郭木金， 廖富榮， 陳 青， 林石明＊， 陳紅運， 沈建國

（1．廈門出入境檢驗檢疫局，廈門 361026； 2．福建農(nóng)林大學生物農(nóng)藥與化學生物學教育部重點實驗室，福州 350002； 3．福建出入境檢驗檢疫局，福州 350003）

豇豆重花葉病毒（Cowpea severe mosaic vir us，CPSMV）為類小 RNA 病毒目（Picor navirales）、伴生豇豆病毒科（Secoviridae）、豇豆花葉病毒亞科（Co movirinae）、豇豆花葉病毒屬（Comovir us）成員。該病毒主要侵染大豆（Gl ycine max）、菜豆（Phaseol us vul garis）、綠豆（Vigna r adiata）、豇豆（Vigna unguicul ata）等豆科植物，造成葉片斑駁和花葉，嚴重時可導致整株萎縮甚至死亡［1－2］。目前，CPSMV主要分布在美洲地區(qū)，如特立尼達和多巴哥、古巴、巴西、墨西哥等國家［2］，而在我國還沒有發(fā)生危害的報道。CPSMV可通過菜豆葉甲（Cer atoma trif urcata）、南美葉甲（Diabr otica speciosa）等昆蟲介體傳播，也可機械傳播，還可通過長豇豆（Vigna sesquipedalis）、豇豆（V．unguicul ata）等種子傳播，以及花粉傳播［3］。由于該病毒的自然寄主在中國廣泛種植，且氣候條件相似，極可能隨著進境的種子和昆蟲在國內(nèi)廣泛傳播，對我國豆科植物生長造成嚴重威脅。

環(huán)介導等溫擴增（loop－mediated isother mal amplification，LAMP）是一種新的核酸擴增技術(shù)，該技術(shù)依賴于能夠識別靶序列上6個特異區(qū)域的引物和一個具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在等溫條件下可高效、快速、高特異地擴增靶序列，具有操作簡單、快速高效、高特異性、高靈敏度等優(yōu)點［4］。自問世以后，已在動物疫病的診斷、動物胚胎性別鑒定、植物病毒檢測和轉(zhuǎn)基因食品檢測等領(lǐng)域逐漸得到推廣應用。針對CPSMV，目前已建立了生物學測定［5］、DAS－ELISA［5］，RT－PCR［3］，IC－RT real－ti me PCR［7］等方法，但還未建立LA MP檢測方法。本研究根據(jù)CPSMV外殼蛋白基因序列設(shè)計特異性引物，通過條件優(yōu)化，建立了CPSMV的RT－LA MP方法，為CPSMV的檢測提供一種新的快速高效、特異、靈敏的檢測方法。

1 材料與方法

1．1 材料

豇豆重花葉病毒（CPSMV）毒源來自美國菌種保藏中心（ATCC）（PV－273）；豇豆花葉病毒（Cowpea mosaic virus，CPMV）、菜豆莢斑駁病毒（Bean pod mottle virus，BPMV）、南瓜花葉病毒（Squash mosaic virus，Sq MV）、安第斯馬鈴薯斑駁病毒（Andean potato mottle vir us，Ap Mo V）陽性對照樣品購自美國Agdia公司；M－MLV Reverse Transcriptase 購自 Pr omega公司；DreamTaqTMDNA Poly merase、d NTPs和RibolockTMRNase Inhibitor購自Fer ments公司；Bst DNA聚合酶大片段購自NEB公司；Tri Pure Isolation Reagent購自Roche公司；其他生化試劑均為常規(guī)分析純試劑。

1．2 引物設(shè)計與合成

根據(jù)Gen Bank數(shù)據(jù)庫中CPSMV外殼蛋白基因已知序列，利用在線引物設(shè)計軟件Pri mer Explore 4．0（http：∥pri merexplorer．jp／ela mp4．0．0／index．ht ml）進行RT－LA MP引物設(shè)計與篩選，由外引物（CPSMV－F3、CPSMV－B3）和內(nèi)引物（CPSMVFIP、CPSMV－BIP）組成，其序列見表1。用于普通RT－PCR擴增的引物CPSMVf和CPSMVr，根據(jù)文獻合成［6］。RT－LA MP引物和普通RT－PCR引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 豇豆重花葉病毒（CPSMV）RT－LAMP檢測引物

1．3 總RNA的提取

按照Tri Pure Isolation Reagent使用說明書進行病葉總RNA的提取。

1．4 RT－PCR

普通RT－PCR擴增的反應體系及條件參照文獻進行［6］。反應結(jié)束后，取5．0μL的PCR產(chǎn)物采用2．0%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1．5 CPSMV RT－LAMP反應體系的優(yōu)化

1．5．1 Mg2＋濃度的篩選

分別設(shè)置0、2．0、4．0、6．0、8．0、10．0、12．0、14．0 mmol／L等8個 Mg2＋濃度梯度，進行 Mg2＋濃度優(yōu)化。在65℃下反應60 min后，取5．0μL的LA MP產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1．5．2 d NTP濃度的篩選

Mg2＋濃度篩選后，分別設(shè)置0、0．2、0．4、0．6、0．8、1．0、1．2、1．4、1．6、1．8 mmol／L 等 10 個d NTP濃度梯度，對d NTP濃度進行篩選。反應條件同上，反應結(jié)束后各取5．0μL進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1．5．3 內(nèi)外引物濃度比的篩選

其他條件保持不變，調(diào)整內(nèi)外引物濃度比。外引物和內(nèi)引物的比例分別為1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10。反應條件同上，反應結(jié)束后各取5．0μL進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1．6 RT－LAMP產(chǎn)物檢測

1．6．1 沉淀反應檢測

在LA MP反應體系中，生成的焦磷酸鹽可與鎂離子結(jié)合而生成白色副產(chǎn)物—焦磷酸鎂沉淀。擴增反應結(jié)束后，經(jīng)5 000 r／min離心5 min，直接用肉眼觀察PCR管底部是否有白色沉淀。如果產(chǎn)生白色沉淀為陽性反應，無白色沉淀則為陰性反應。

1．6．2 染色肉眼檢測

擴增反應結(jié)束后，加入1．0μL SYBR Green I染料，觀察LA MP反應液是否發(fā)生顏色變化。如果產(chǎn)生綠色為陽性反應，橙色則為陰性反應。

1．6．3 瓊脂糖凝膠電泳檢測

反應結(jié)束后，取5．0μL的反應產(chǎn)物，于2．0%瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測。

1．7 特異性試驗

利用所建立的CPSMV RT－LA MP方法，分別對BPMV、CPMV、Sq MV、Ap Mo V等同屬病毒的陽性樣品，以及健康的豇豆、大豆、菜豆等寄主植物的葉片樣品進行檢測。

1．8 靈敏性試驗

將c DNA模板進行10倍系列稀釋，即稀釋成1．0×10－1到1．0×10－8的8個濃度，分別進行 RTLA MP和RT－PCR檢測，對比兩者之間的檢測靈敏度。

2 結(jié)果與分析

2．1 RT－LAMP反應體系的優(yōu)化結(jié)果

以豇豆重花葉病毒c DNA為模板，CPSMV－F3、CPSMV－B3、CPSMV－FIP、CPSMV－BIP為引物，分別對Mg2＋濃度、d NTP濃度、內(nèi)外引物濃度比例進行優(yōu)化，LA MP擴增后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。從Mg2＋濃度試驗結(jié)果看，隨著 Mg2＋濃度升高擴增的條帶也越來越清晰；當 Mg2＋濃度達到8．0 mmol／L后，隨著 Mg2＋濃度升高，條帶亮度沒有明顯變化。因此，最佳的 Mg2＋濃度為8．0 mmol／L（圖1a）。

d NTP濃度試驗結(jié)果表明，隨著d NTP濃度升高擴增的條帶也越來越清晰，當濃度為0．6～1．0 mmol／L時，條帶亮度沒有明顯區(qū)別；當濃度達到1．2 mmol／L時，隨著濃度的提高，條帶亮度逐漸降低；當濃度達到1．6 mmol／L時，沒有反應產(chǎn)生。因此，最佳的d NTP濃度選擇1．0 mmol／L（圖1b）。

內(nèi)外引物濃度試驗結(jié)果表明，隨著內(nèi)外引物濃度比例的逐漸增加擴增的條帶也越來越清晰；當外引物和內(nèi)引物比例在1∶6到1∶10之間時，條帶亮度沒有明顯改變。為節(jié)省材料，選擇外引物和內(nèi)引物濃度比例1∶6為最佳濃度比（圖1c）。

綜上所述，所建立CPSMV RT－LA MP檢測方法的最佳反應體系為Bst DNA聚合酶（8 U／μL）1．0 μL，10×Bst DNA聚合酶緩沖液2．5μL，c DNA模板2．0μL，MgSO4（100 mmol／L）2．0μL，甜菜堿（betaine）（5 mol／L）4．0μL，d NTP（10．0 mmol／L）2．0μL，10．0μmol／L CPSMV－FIP和BIP各3．0μL，10μmol／L CPSMV－F3和 B3 各0．5μL，加滅菌水補充至25μL。反應條件為：65℃溫浴60 min。

此外，包括空白對照在內(nèi)的各泳道中，均產(chǎn)生小于100 bp的引物二聚體（圖1）。

圖1 CPSMV RT－LAMP檢測反應體系優(yōu)化

2．2 RT－LAMP產(chǎn)物檢測

沉淀觀察結(jié)果表明，在CPSMV陽性樣品的反應管中生成白色沉淀（白色箭頭所示），而在陰性對照的反應管中沒有生成白色沉淀（如圖2a）。向擴增產(chǎn)物中加入1．0μL SYBR Green I染料后，顏色反應結(jié)果表明，在CPSMV陽性樣品的反應管中產(chǎn)生綠色，而陰性對照的反應管則仍為橙色（如圖2b）。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，可以觀察到CPSMV陽性樣品產(chǎn)生典型的梯狀條帶，而陰性樣品則沒有產(chǎn)生梯狀條帶，但產(chǎn)生小于100 bp的引物二聚體（如圖2c）。

圖2 CPSMV RT－LAMP檢測結(jié)果判定

2．3 RT－LAMP的靈敏性試驗

將CPSMV c DNA模板進行10倍系列稀釋，分別進行 RT－LA MP和 RT－PCR 檢測。RT－LA MP試驗結(jié)果表明，當濃度稀釋到10－3倍時，條帶逐漸變淡，直至10－6倍時仍有清晰的擴增條帶出現(xiàn)；而稀釋到10－7倍時，沒有產(chǎn)生典型的梯狀條帶（圖3a）。常規(guī)RT－PCR檢測結(jié)果表明，在未稀釋的模板中除了產(chǎn)生約350 bp的特異性條帶外，還產(chǎn)生大于1 500 bp、約900 bp和約230 bp的3條非特異性條帶；隨著模板濃度的逐漸降低，特異性條帶亮度也逐漸變淡，非特異性條帶消失；當稀釋到10－6倍時，沒有任何條帶出現(xiàn)（圖3b）。以上結(jié)果表明，所建立的RT－LAMP檢測方法靈敏度比常規(guī)RT－PCR檢測法高10倍。

圖3 RT－LAMP和RT－PCR靈敏度試驗結(jié)果

2．4 RT－LAMP的特異性試驗

利用所建立的CPSMV RT－LA MP方法，分別對BPMV、CPMV、Sq MV、Ap Mo V 等同屬病毒，以及健康的豇豆、大豆、菜豆等寄主植物進行檢測。結(jié)果表明，在同屬的BPMV、CPMV、Sq MV、Ap Mo V等病毒中均未產(chǎn)生典型的梯狀條帶，CPSMV寄主豇豆、大豆、菜豆等健康植物也未產(chǎn)生典型的梯狀條帶（圖4）。因此，所建立的CPSMV LA MP檢測方法并不會與同屬的其他病毒及其寄主植物產(chǎn)生交叉反應，顯示出良好的特異性。

圖4 RT－LAMP的特異性試驗結(jié)果

3 討論

LAMP方法自建立以來，已逐漸在植物病毒的檢測中得到推廣應用。目前，已建立了日本山藥花葉病毒（Japanese yam mosaic virus，JYMV）［8］、番茄黃曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）［9］、番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）［10］、馬鈴薯Y病毒（Potato vir us Y，PVY）［11］、建蘭花葉病毒（Cy mbidiu m mosaic vir us，Cy MV）［12］、煙草花葉病毒（Tobacco mosaic vir us，T MV）［13］、菜豆莢斑駁病毒（Bean pod mottle vir us，BPMV）［14］等多種病毒的LA MP檢測方法。本研究根據(jù)豇豆重花葉病毒外殼蛋白基因序列設(shè)計特異性引物，通過條件優(yōu)化，建立了CPSMV的RT－LA MP方法。

LA MP方法具有良好的靈敏度，如聞偉剛等建立的BPMV的RT－LAMP方法的檢測靈敏度比RT－PCR方法高1 000倍［14］。本研究的靈敏度檢測表明，所建立的RT－LA MP檢測靈敏度可以比李彬等建立的常規(guī) RT－PCR［6］靈敏度高10倍。另外，由于該技術(shù)所利用的引物需要識別靶序列上6個特異性區(qū)域，而常規(guī)的RT－PCR方法引物只識別靶序列上2個特異性區(qū)域，所以在理論上具有更高的特異性。本試驗結(jié)果表明，所建立的CPSMV RT－LAMP方法并不會與同屬的其他病毒、及病毒的寄主植物產(chǎn)生交叉反應，顯示出良好的特異性。此外，RT－LA MP方法反轉(zhuǎn)錄和LA MP反應均可在水浴鍋（或恒溫孵育器）中完成，且只需要1個溫度在1 h內(nèi)完成，操作也相對簡便。RT－LA MP的結(jié)果檢測除了可以利用常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳方法，還可以使用DNA染料染色、沉淀觀察等方法進行快速檢測。因此，與常規(guī)的RT－PCR方法相比，建立的CPSMV RT－LA MP方法具有更高的靈敏度、良好的特異性，操作也更為簡便、快速。

［1］ Umaharan P，Haque S Q，Ariyananyagam R P．Identification of resistance to Cowpea severe mosaic vir us （Trinidad isolate）in cowpea［Vigna unguicul ata （L．）Walp．］［J］．Trop Agric（Trinidad），1997，74：324－328．

［2］ CAB Inter national．Cr op pr otection co mpendiu m （2005 edition）［DB／OL］．Wallingfor d，UK：CAB Inter national，2005．www．cabicompendiu m．org／cpc．

［3］ ICTVd B－The Universal virus database，version 4［DB／OL］．http：∥www．ncbi．nl m．nih．gov／ICTVdb／ICTVd B／index．htm．

［4］ Noto mi T，Okaya ma H，Masubuchi H，et al．Loop－mediated isother mal amplification of DNA［J］．Nucleic Acids Research，2000，28（12）：e63．

［5］ 李桂芬，李明福，魏梅生，等．SN／T 2055－2008豇豆重花葉病毒檢疫鑒定方法［S］．中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準．北京：中國標準出版社出版，2008．

［6］ 李彬，吳翠萍，粟寒，等．一種豇豆重花葉病毒RT－PCR檢測方法的研究［J］．植物檢疫，2010，24（4）：28－32．

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［10］Fukuta S，Ohishi K，Yoshida K，et al．Develop mentof i mmunocapture reverse transcription loop－mediated isother mal amplification for the detection of to mato spotted wilt vir us from chrysanthemu m［J］．J Vir ol Met hods，2004，121：49－55．

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［14］聞偉剛，楊翠云，崔俊霞，等．RT－LAMP技術(shù)檢測菜豆莢斑駁病毒的研究［J］．植物保護，2010，36（6）：139－141．