趙艷龍， 常金梅， 何衍彪， 李國平， 周文釗

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所，湛江 524091）

劍麻（Agave sisal ana）是龍舌蘭科龍舌蘭屬的硬質(zhì)纖維作物，其纖維廣泛用于制作繩纜、鋼索繩心和編織劍麻地毯、工藝品等［1－2］，是國防、漁業(yè)、航海、石油、工礦等領(lǐng)域的重要原料。斑馬紋病是我國劍麻生產(chǎn)中發(fā)生最普遍、危害性最大的一種真菌病害，病原菌為煙草疫霉（Phytophthor a nicotianae Breda de Haan），該菌能侵染劍麻植株地上各部分，引起葉斑、莖腐和軸腐，給劍麻生產(chǎn)帶來嚴(yán)重?fù)p失［1，3］。目前生產(chǎn)上以“治水”（即控制麻園田間濕度）為主要防治手段，但是受品種特性、氣候條件和種植結(jié)構(gòu)的制約，始終無法有效地控制病情，目前普遍認(rèn)為選育和應(yīng)用抗病品種是唯一經(jīng)濟(jì)高效的防治措施［4－5］。但至今對劍麻斑馬紋病的抗性鑒定還沒有形成一套完善的方法，使得抗病品種的利用受到較大的限制，嚴(yán)重影響了劍麻抗斑馬紋病育種工作的進(jìn)展。本研究對劍麻斑馬病紋最適宜接種條件進(jìn)行摸索，同時(shí)利用活體葉片接種和離體葉片接種兩種方式對生產(chǎn)中有抗性差異的8個(gè)種質(zhì)抗病性進(jìn)行評價(jià)，以期建立一套相對完善的劍麻斑馬紋病的抗性鑒定方法，為劍麻抗病育種提供理論基礎(chǔ)和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 病菌的收集及接種體準(zhǔn)備

本試驗(yàn)所用菌株采自廣東省東方劍麻集團(tuán)農(nóng)業(yè)研究所劍麻園。以常規(guī)組織分離法從劍麻斑馬紋病病株上分離病原物并純化。按柯赫氏法則驗(yàn)證并鑒定確認(rèn)為煙草疫霉菌后，保存?zhèn)溆谩⒉【贑A培養(yǎng)基（胡蘿卜200 g；瓊脂15 g；蒸餾水1 000 mL；p H 6．0）上25℃恒溫培養(yǎng)5 d后，用直徑為8 mm的滅菌打孔器，在距離中心3 c m處打下菌餅作為接種體。

1．2 供試劍麻種質(zhì)及培育

選用生產(chǎn)中具有抗性差異的8個(gè)劍麻種質(zhì)：‘H．11648’（Agave hybrid no．11648）、‘廣西76416’（Agave hybrid 76416）、普通劍麻（A．sisalana Perr）、‘粵西114’（Agave hybrid yuexi No．114）、龍舌蘭（A．a(chǎn)mericana Linn．）、‘東109’（A．potator um var．a(chǎn)．h‘Dongfanghong No．109’）、‘東 5’（A．potator u m var．a(chǎn)．h‘Dongf anghong No．5’）和灰葉劍麻（A．f ourcroydes Lemaire），其中‘H．11648’是感病品種。用盆栽法培育各種苗至存葉20片以上，選生長健壯、無病蟲害的苗備用。

1．3 創(chuàng)傷對接種效果的影響測定

選用感病品種‘H．11648’為試驗(yàn)材料，按1．2中的方法育苗。從每株麻苗中下部割取完好的葉片，用70%乙醇棉球?qū)θ~片表面擦拭消毒。在消毒后葉片中部的正面分別進(jìn)行創(chuàng)傷（針刺，下同）和未創(chuàng)傷處理，將打下的菌餅菌絲生長面向下分別貼在葉片中部的正面，置于保鮮盒內(nèi)，用無菌棉覆蓋菌餅保濕，48 h后除去棉花及菌餅，每處理10個(gè)葉片，重復(fù)3次，25℃下培養(yǎng)。

1．4 不同培養(yǎng)溫度條件下接種效果的比較

選用感病品種‘H．11648’為試驗(yàn)材料，按1．2中的方法育苗。葉片割取、處理與接種同1．3，分別置于20、25、30、35℃和40℃下保濕培養(yǎng)，48 h后除去棉花及菌餅，每處理10個(gè)葉片，重復(fù)3次。

對于上述試驗(yàn)，接種后3、6 d和9 d分別觀察病害發(fā)展情況，用直尺測量并記錄病斑的大?。ㄒ圆“叩目v向長度表示）。用鄧肯氏新復(fù)極差法對上述各處理的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1．5 不同接種方法對劍麻抗性評價(jià)測定

選用生產(chǎn)中具有抗性差異的8個(gè)劍麻種質(zhì)，按1．2中的方法育苗。

1．5．1 活體葉片接種

8個(gè)劍麻種質(zhì)各5株，于不同方向選取每株種苗中下部的完好葉片5片，用70%乙醇棉球?qū)θ~片表面擦拭消毒，再用滅菌后的大頭針在距離葉基部10 c m處將葉片正面的表皮刺破，將菌餅的菌絲生長面向下貼在針刺的位置，用無菌棉覆蓋菌餅保濕，28℃，濕度80%以上的室內(nèi)條件下培養(yǎng)，48 h后除去棉花及菌餅，每處理重復(fù)3次。

1．5．2 離體葉片接種

8個(gè)劍麻種質(zhì)各5株，于不同方向選取每株種苗中下部的完好葉片5片，將其割下，用70%乙醇棉球?qū)θ~片表面擦拭消毒。在消毒后葉片中部的正面進(jìn)行創(chuàng)傷處理，將打下的菌餅的菌絲生長面向下貼在葉片中部的正面后，28℃下保濕培養(yǎng)，每處理重復(fù)3次。

1．5．3 觀察、記錄病情和病害分級

對于上述試驗(yàn)，接種后3、6 d和9 d分別觀察病害發(fā)展情況，用直尺測量并記錄病斑的大?。ㄒ圆“叩目v向長度表示），根據(jù)9 d后測量并記錄下的病斑大小，為形成抗性差異，將活體葉片接種后病害按如下標(biāo)準(zhǔn)分級：0級，葉片無病斑；1級，葉片出現(xiàn)病斑，但不擴(kuò)展；2級，葉片出現(xiàn)病斑并向外擴(kuò)展；3級，葉片病斑向葉基部擴(kuò)展達(dá)5．0 c m以上；4級，病斑擴(kuò)展到葉基部或莖部。離體葉片接種分級標(biāo)準(zhǔn)：0級，葉片無病斑；1級，0＜病斑長度≤10．0 c m；2級，10．0 c m＜病斑長度≤13．0 c m；3級，13．0c m＜病斑長度≤16．0 c m；4級，16．0 c m＜病斑長度≤19．0 c m；5級，病斑長度＞19．0 c m。

1．5．4 病情指數(shù)計(jì)算

根據(jù)記錄下的數(shù)據(jù)和病害分級情況，按公式（1）計(jì)算病情指數(shù)。

式中：i—病害級別；Ni—第i級病害的病斑數(shù)；m—最高病害級別；M—調(diào)查總病斑數(shù)。

1．5．5 抗病性評價(jià)及驗(yàn)證

根據(jù)鑒定材料病情指數(shù)對各種質(zhì)資源的抗病性進(jìn)行評價(jià)，評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表1。評價(jià)結(jié)果與各種質(zhì)的大田抗病性進(jìn)行比較，以驗(yàn)證該抗病性鑒定體系的正確性。

表1 劍麻斑馬紋病抗病性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與分析

2．1 創(chuàng)傷對接種效果的影響

創(chuàng)傷條件對劍麻斑馬紋病菌侵染葉片影響見表2。從表中可知，處理后3 d，兩種處理方式已產(chǎn)生明顯差異，接種后9 d，創(chuàng)傷處理后的葉片病斑長度已達(dá)到18．75 c m，是未創(chuàng)傷處理的7．68倍，且差異達(dá)顯著水平，說明創(chuàng)傷對病菌的侵染與病斑的擴(kuò)展起積極的作用，接種效果顯著好于未創(chuàng)傷處理。

表2 創(chuàng)傷條件對接種效果的影響1）

2．2 溫度對接種效果的影響

溫度對劍麻斑馬紋病菌侵染的影響如表3所示，在20～35℃范圍內(nèi)，病菌均可侵染成功，其中在25～30℃范圍內(nèi)侵染和擴(kuò)展速度最快，接種9 d后其病斑長度在18．00 c m左右，顯著高于其他溫度處理，說明25～30℃是最合適的培養(yǎng)溫度。從表3中還可以看出，當(dāng)溫度達(dá)到35℃時(shí)，基本不能形成侵染，接種后9 d其病斑長度僅0．41 c m，在40℃下，病菌不能侵染。

2．3 抗病性評價(jià)及其結(jié)果的驗(yàn)證

根據(jù)病情指數(shù)及抗性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)得到各種質(zhì)的抗病性，并與各種質(zhì)大田抗病性相比較，其結(jié)果見表4。從表4可以看出，兩種接種方法，抗病性鑒定結(jié)果與大田抗性基本吻合。通過活體接種鑒定，7個(gè)種質(zhì)的抗病性與實(shí)際生產(chǎn)全部符合，而通過離體葉片接種鑒定，7個(gè)種質(zhì)的抗病性只有‘粵西114’與實(shí)際生產(chǎn)不符，因而相對于離體葉片接種，活體葉片接種更能準(zhǔn)確地鑒定劍麻種質(zhì)的抗病性。

表4 劍麻種質(zhì)資源抗病性及與生產(chǎn)上抗病性比較

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，劍麻斑馬紋病菌最適宜的接種方法是將葉片針刺創(chuàng)傷后，將斑馬紋病菌菌塊的菌絲生長面向下貼在針刺的位置，置于25～30℃條件下保濕培養(yǎng)較易感病，因此建議麻農(nóng)在割葉時(shí)避免雨天和濕度高的情況下操作，以便減少病害的發(fā)生?；铙w接種鑒定方法和離體接種鑒定方法，都可用來檢測劍麻種質(zhì)對斑馬紋病的抗性，而活體葉片接種鑒定抗病性更加準(zhǔn)確。

用離體葉片接種鑒定方法得到‘粵西114’的抗病性為中感，而其實(shí)際抗病性為中抗，鑒定結(jié)果與實(shí)際生產(chǎn)發(fā)生了偏差，可能是因?yàn)橛秒x體葉片接種時(shí)，葉片因?yàn)殡x開了植物體，其抵抗病菌侵入的能力發(fā)生了變化而致。同時(shí)作者發(fā)現(xiàn)，用離體葉片接種與用活體葉片接種兩者之間，其病情指數(shù)有時(shí)前者大，有時(shí)后者要大。但離體葉片接種后病斑的擴(kuò)展速度明顯較活體葉片接種后病斑的擴(kuò)展速度快，這與袁慶華等報(bào)道的“離體葉接種的發(fā)病情況比田間或室內(nèi)整株接種嚴(yán)重”一致［6］。

關(guān)于作物品種抗病性鑒定方法，傳統(tǒng)方式一般都是將作物種植于鑒定圃，讓其自然發(fā)病，通過觀察各種質(zhì)病害的嚴(yán)重程度來判定其抗病性，這種方法比較可靠，操作也比較簡單，但該方法需要在具備發(fā)病的自然環(huán)境條件下才能實(shí)施，而且需要時(shí)間長［7－8］。目前關(guān)于劍麻種質(zhì)對斑馬紋病的抗病性鑒定不同接種方法的比較研究尚無人報(bào)道，作者嘗試研究一種人為接種鑒定方法，通過活體葉片接種鑒定和離體葉片接種鑒定，均能比較準(zhǔn)確地鑒定各種質(zhì)的抗病性，且這兩種鑒定方法操作簡單，試驗(yàn)時(shí)間短。該試驗(yàn)僅是對劍麻種質(zhì)抗病性鑒定作了初步的探索，與實(shí)際生產(chǎn)相比還存在一定的差異性，因此要通過不斷改進(jìn)，不斷完善，使其能夠快速而又可靠地鑒定劍麻種質(zhì)的抗病性，為劍麻抗病育種及斑馬紋病菌的致病力研究等提供良好的研究平臺。

［1］ 李道和．劍麻栽培［M］．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998．

［2］ 孫光明．劍麻栽培工［M］．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2007．

［3］ 趙艷龍，何衍彪，詹儒林．我國劍麻主要病蟲害的發(fā)生與防治［J］．中國麻業(yè)科學(xué)，2007，29（6）：334－338．

［4］ Peregrine W T．Investigations on chemical control of zebra disease in Agave hybrid no．11648［J］．Annals of Applied Biology，2008，63（1）：45－51．

［5］ Allena D J．Control of zebra disease of Agave hybrids by breeding for resistance to Phytophthor a spp．［J］．Inter national Jour nal of Pest Management，1971，17（1）：42－46．

［6］ 袁慶華，張文淑，李敏．苜蓿褐斑病的離體葉接種研究［J］．草地學(xué)報(bào)，2001，9（1）：21－24．

［7］ 王子斌，左示敏，李剛，等．水稻抗紋枯病苗期快速鑒定技術(shù)研究［J］．植物病理學(xué)報(bào)，2009，39（2）：174－182．

［8］ 王豐，馬躍，高秀巖，等．草莓品種對炭疽病抗性的鑒定技術(shù)研究［J］．果樹學(xué)報(bào)，2008，25（4）：542－547．