趙艷龍， 常金梅， 何衍彪， 李國平， 周文釗

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所，湛江 524091）

劍麻（Agave sisal ana）是龍舌蘭科龍舌蘭屬的硬質(zhì)纖維作物，其纖維廣泛用于制作繩纜、鋼索繩心和編織劍麻地毯、工藝品等［1－2］，是國防、漁業(yè)、航海、石油、工礦等領(lǐng)域的重要原料。斑馬紋病是我國劍麻生產(chǎn)中發(fā)生最普遍、危害性最大的一種真菌病害，病原菌為煙草疫霉（Phytophthor a nicotianae Breda de Haan），該菌能侵染劍麻植株地上各部分，引起葉斑、莖腐和軸腐，給劍麻生產(chǎn)帶來嚴重損失［1，3］。目前生產(chǎn)上以“治水”（即控制麻園田間濕度）為主要防治手段，但是受品種特性、氣候條件和種植結(jié)構(gòu)的制約，始終無法有效地控制病情，目前普遍認為選育和應(yīng)用抗病品種是唯一經(jīng)濟高效的防治措施［4－5］。但至今對劍麻斑馬紋病的抗性鑒定還沒有形成一套完善的方法，使得抗病品種的利用受到較大的限制，嚴重影響了劍麻抗斑馬紋病育種工作的進展。本研究對劍麻斑馬病紋最適宜接種條件進行摸索，同時利用活體葉片接種和離體葉片接種兩種方式對生產(chǎn)中有抗性差異的8個種質(zhì)抗病性進行評價，以期建立一套相對完善的劍麻斑馬紋病的抗性鑒定方法，為劍麻抗病育種提供理論基礎(chǔ)和實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 病菌的收集及接種體準備

本試驗所用菌株采自廣東省東方劍麻集團農(nóng)業(yè)研究所劍麻園。以常規(guī)組織分離法從劍麻斑馬紋病病株上分離病原物并純化。按柯赫氏法則驗證并鑒定確認為煙草疫霉菌后，保存?zhèn)溆谩⒉【贑A培養(yǎng)基（胡蘿卜200 g；瓊脂15 g；蒸餾水1 000 mL；p H 6．0）上25℃恒溫培養(yǎng)5 d后，用直徑為8 mm的滅菌打孔器，在距離中心3 c m處打下菌餅作為接種體。

1．2 供試劍麻種質(zhì)及培育

選用生產(chǎn)中具有抗性差異的8個劍麻種質(zhì)：‘H．11648’（Agave hybrid no．11648）、‘廣西76416’（Agave hybrid 76416）、普通劍麻（A．sisalana Perr）、‘粵西114’（Agave hybrid yuexi No．114）、龍舌蘭（A．a(chǎn)mericana Linn．）、‘東109’（A．potator um var．a(chǎn)．h‘Dongfanghong No．109’）、‘東 5’（A．potator u m var．a(chǎn)．h‘Dongf anghong No．5’）和灰葉劍麻（A．f ourcroydes Lemaire），其中‘H．11648’是感病品種。用盆栽法培育各種苗至存葉20片以上，選生長健壯、無病蟲害的苗備用。

1．3 創(chuàng)傷對接種效果的影響測定

選用感病品種‘H．11648’為試驗材料，按1．2中的方法育苗。從每株麻苗中下部割取完好的葉片，用70%乙醇棉球?qū)θ~片表面擦拭消毒。在消毒后葉片中部的正面分別進行創(chuàng)傷（針刺，下同）和未創(chuàng)傷處理，將打下的菌餅菌絲生長面向下分別貼在葉片中部的正面，置于保鮮盒內(nèi)，用無菌棉覆蓋菌餅保濕，48 h后除去棉花及菌餅，每處理10個葉片，重復(fù)3次，25℃下培養(yǎng)。

1．4 不同培養(yǎng)溫度條件下接種效果的比較

選用感病品種‘H．11648’為試驗材料，按1．2中的方法育苗。葉片割取、處理與接種同1．3，分別置于20、25、30、35℃和40℃下保濕培養(yǎng)，48 h后除去棉花及菌餅，每處理10個葉片，重復(fù)3次。

對于上述試驗，接種后3、6 d和9 d分別觀察病害發(fā)展情況，用直尺測量并記錄病斑的大小（以病斑的縱向長度表示）。用鄧肯氏新復(fù)極差法對上述各處理的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

1．5 不同接種方法對劍麻抗性評價測定

選用生產(chǎn)中具有抗性差異的8個劍麻種質(zhì)，按1．2中的方法育苗。

1．5．1 活體葉片接種

8個劍麻種質(zhì)各5株，于不同方向選取每株種苗中下部的完好葉片5片，用70%乙醇棉球?qū)θ~片表面擦拭消毒，再用滅菌后的大頭針在距離葉基部10 c m處將葉片正面的表皮刺破，將菌餅的菌絲生長面向下貼在針刺的位置，用無菌棉覆蓋菌餅保濕，28℃，濕度80%以上的室內(nèi)條件下培養(yǎng)，48 h后除去棉花及菌餅，每處理重復(fù)3次。

1．5．2 離體葉片接種

8個劍麻種質(zhì)各5株，于不同方向選取每株種苗中下部的完好葉片5片，將其割下，用70%乙醇棉球?qū)θ~片表面擦拭消毒。在消毒后葉片中部的正面進行創(chuàng)傷處理，將打下的菌餅的菌絲生長面向下貼在葉片中部的正面后，28℃下保濕培養(yǎng)，每處理重復(fù)3次。

1．5．3 觀察、記錄病情和病害分級

對于上述試驗，接種后3、6 d和9 d分別觀察病害發(fā)展情況，用直尺測量并記錄病斑的大小（以病斑的縱向長度表示），根據(jù)9 d后測量并記錄下的病斑大小，為形成抗性差異，將活體葉片接種后病害按如下標準分級：0級，葉片無病斑；1級，葉片出現(xiàn)病斑，但不擴展；2級，葉片出現(xiàn)病斑并向外擴展；3級，葉片病斑向葉基部擴展達5．0 c m以上；4級，病斑擴展到葉基部或莖部。離體葉片接種分級標準：0級，葉片無病斑；1級，0＜病斑長度≤10．0 c m；2級，10．0 c m＜病斑長度≤13．0 c m；3級，13．0c m＜病斑長度≤16．0 c m；4級，16．0 c m＜病斑長度≤19．0 c m；5級，病斑長度＞19．0 c m。

1．5．4 病情指數(shù)計算

根據(jù)記錄下的數(shù)據(jù)和病害分級情況，按公式（1）計算病情指數(shù)。

式中：i—病害級別；Ni—第i級病害的病斑數(shù)；m—最高病害級別；M—調(diào)查總病斑數(shù)。

1．5．5 抗病性評價及驗證

根據(jù)鑒定材料病情指數(shù)對各種質(zhì)資源的抗病性進行評價，評價標準見表1。評價結(jié)果與各種質(zhì)的大田抗病性進行比較，以驗證該抗病性鑒定體系的正確性。

表1 劍麻斑馬紋病抗病性評價標準

2 結(jié)果與分析

2．1 創(chuàng)傷對接種效果的影響

創(chuàng)傷條件對劍麻斑馬紋病菌侵染葉片影響見表2。從表中可知，處理后3 d，兩種處理方式已產(chǎn)生明顯差異，接種后9 d，創(chuàng)傷處理后的葉片病斑長度已達到18．75 c m，是未創(chuàng)傷處理的7．68倍，且差異達顯著水平，說明創(chuàng)傷對病菌的侵染與病斑的擴展起積極的作用，接種效果顯著好于未創(chuàng)傷處理。

表2 創(chuàng)傷條件對接種效果的影響1）

2．2 溫度對接種效果的影響

溫度對劍麻斑馬紋病菌侵染的影響如表3所示，在20～35℃范圍內(nèi)，病菌均可侵染成功，其中在25～30℃范圍內(nèi)侵染和擴展速度最快，接種9 d后其病斑長度在18．00 c m左右，顯著高于其他溫度處理，說明25～30℃是最合適的培養(yǎng)溫度。從表3中還可以看出，當溫度達到35℃時，基本不能形成侵染，接種后9 d其病斑長度僅0．41 c m，在40℃下，病菌不能侵染。

2．3 抗病性評價及其結(jié)果的驗證

根據(jù)病情指數(shù)及抗性評價標準得到各種質(zhì)的抗病性，并與各種質(zhì)大田抗病性相比較，其結(jié)果見表4。從表4可以看出，兩種接種方法，抗病性鑒定結(jié)果與大田抗性基本吻合。通過活體接種鑒定，7個種質(zhì)的抗病性與實際生產(chǎn)全部符合，而通過離體葉片接種鑒定，7個種質(zhì)的抗病性只有‘粵西114’與實際生產(chǎn)不符，因而相對于離體葉片接種，活體葉片接種更能準確地鑒定劍麻種質(zhì)的抗病性。

表4 劍麻種質(zhì)資源抗病性及與生產(chǎn)上抗病性比較

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，劍麻斑馬紋病菌最適宜的接種方法是將葉片針刺創(chuàng)傷后，將斑馬紋病菌菌塊的菌絲生長面向下貼在針刺的位置，置于25～30℃條件下保濕培養(yǎng)較易感病，因此建議麻農(nóng)在割葉時避免雨天和濕度高的情況下操作，以便減少病害的發(fā)生?；铙w接種鑒定方法和離體接種鑒定方法，都可用來檢測劍麻種質(zhì)對斑馬紋病的抗性，而活體葉片接種鑒定抗病性更加準確。

用離體葉片接種鑒定方法得到‘粵西114’的抗病性為中感，而其實際抗病性為中抗，鑒定結(jié)果與實際生產(chǎn)發(fā)生了偏差，可能是因為用離體葉片接種時，葉片因為離開了植物體，其抵抗病菌侵入的能力發(fā)生了變化而致。同時作者發(fā)現(xiàn)，用離體葉片接種與用活體葉片接種兩者之間，其病情指數(shù)有時前者大，有時后者要大。但離體葉片接種后病斑的擴展速度明顯較活體葉片接種后病斑的擴展速度快，這與袁慶華等報道的“離體葉接種的發(fā)病情況比田間或室內(nèi)整株接種嚴重”一致［6］。

關(guān)于作物品種抗病性鑒定方法，傳統(tǒng)方式一般都是將作物種植于鑒定圃，讓其自然發(fā)病，通過觀察各種質(zhì)病害的嚴重程度來判定其抗病性，這種方法比較可靠，操作也比較簡單，但該方法需要在具備發(fā)病的自然環(huán)境條件下才能實施，而且需要時間長［7－8］。目前關(guān)于劍麻種質(zhì)對斑馬紋病的抗病性鑒定不同接種方法的比較研究尚無人報道，作者嘗試研究一種人為接種鑒定方法，通過活體葉片接種鑒定和離體葉片接種鑒定，均能比較準確地鑒定各種質(zhì)的抗病性，且這兩種鑒定方法操作簡單，試驗時間短。該試驗僅是對劍麻種質(zhì)抗病性鑒定作了初步的探索，與實際生產(chǎn)相比還存在一定的差異性，因此要通過不斷改進，不斷完善，使其能夠快速而又可靠地鑒定劍麻種質(zhì)的抗病性，為劍麻抗病育種及斑馬紋病菌的致病力研究等提供良好的研究平臺。

［1］ 李道和．劍麻栽培［M］．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998．

［2］ 孫光明．劍麻栽培工［M］．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2007．

［3］ 趙艷龍，何衍彪，詹儒林．我國劍麻主要病蟲害的發(fā)生與防治［J］．中國麻業(yè)科學(xué)，2007，29（6）：334－338．

［4］ Peregrine W T．Investigations on chemical control of zebra disease in Agave hybrid no．11648［J］．Annals of Applied Biology，2008，63（1）：45－51．

［5］ Allena D J．Control of zebra disease of Agave hybrids by breeding for resistance to Phytophthor a spp．［J］．Inter national Jour nal of Pest Management，1971，17（1）：42－46．

［6］ 袁慶華，張文淑，李敏．苜蓿褐斑病的離體葉接種研究［J］．草地學(xué)報，2001，9（1）：21－24．

［7］ 王子斌，左示敏，李剛，等．水稻抗紋枯病苗期快速鑒定技術(shù)研究［J］．植物病理學(xué)報，2009，39（2）：174－182．

［8］ 王豐，馬躍，高秀巖，等．草莓品種對炭疽病抗性的鑒定技術(shù)研究［J］．果樹學(xué)報，2008，25（4）：542－547．