江 曙， 段金廒， 錢大瑋， 陶金華

（1．南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南京 210046； 2．南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，南通 226019）

內(nèi)生真菌是指在植物體內(nèi)完成其生活史的部分或全部，生長于植物組織細(xì)胞間，分布于葉鞘、種子、花、莖、葉片和根中，但又不引起任何病癥的微生物，突出強調(diào)了內(nèi)生真菌與植物的互惠共生關(guān)系［1］。Selosse等研究表明，被內(nèi)生真菌感染的植物遭受到真菌病害影響的程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于沒有感染內(nèi)生真菌的植物［2］。由此可見，內(nèi)生真菌可提高宿主植物對生物脅迫的抵抗能力［3］。

近年來的研究表明，內(nèi)生真菌是一個多樣性十分豐富的微生物類群，能夠產(chǎn)生一些結(jié)構(gòu)新穎、類型多樣的次生代謝產(chǎn)物，如萜類、生物堿類、芳香類、肽類等化合物，具有較強的抑菌、殺菌活性［4－6］，是臨床抗菌藥物和生物農(nóng)藥研究與開發(fā)的潛在資源，在農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景。目前關(guān)于藥用植物內(nèi)生真菌抗菌活性的研究較少，當(dāng)歸內(nèi)生真菌的研究還未見相關(guān)報道，本文主要研究當(dāng)歸內(nèi)生真菌及其代謝產(chǎn)物的抗菌活性，為進(jìn)一步尋找天然活性物質(zhì)及生物農(nóng)藥提供依據(jù)，為植物病原真菌的生物防治以及發(fā)展綠色中藥材探索新的途徑。

1 材料與方法

1．1 材料

1.1.1 供試菌株

當(dāng)歸內(nèi)生真菌（分離自當(dāng)歸新鮮植株），小麥赤霉病菌（Fusariu m gr a minear u m Sch w．），番茄早疫病菌（Alter naria sol ani），番茄灰霉病菌（Botr ytis cinerea），水稻紋枯病菌（Rhizoctonia sol ani），南京中醫(yī)藥大學(xué)生物制藥教研室保藏。

1．1．2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基［7］；內(nèi)生真菌發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖1%，黃豆餅粉2%，淀粉1%，MySO4·7 H2O 0．3%，KH2PO40．3%，NH4Cl 0．3%，自然p H，121℃滅菌30 min。

1．1．3 儀器與設(shè)備

高速離心機（TGL－6B，上海安亭科學(xué)儀器廠），微量移液器（QYQ，北京金花），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE－52A，上海亞榮生化儀器廠）。

1．2 方法

1．2．1 內(nèi)生真菌的活化

將4℃冰箱中保藏的內(nèi)生真菌接種到新鮮的PDA斜面上，于28℃培養(yǎng)6～7 d。

1．2．2 內(nèi)生真菌的發(fā)酵及樣品處理

分別挑取內(nèi)生真菌菌塊接種到含有40 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的150 mL三角瓶中，于28℃，200 r／min培養(yǎng)5 d。發(fā)酵結(jié)束后，10 000 r／min離心10 min，上清液于60℃減壓濃縮至4．0 mL，經(jīng)細(xì)菌過濾器過濾后，得無菌濃縮液。

1．2．3 抗植物病原真菌活性的測定［8－9］

1．2．3．1 拮抗試驗

挑取直徑為6 mm的小塊植物病原真菌接種于PDA平板的中央，然后將不同的內(nèi)生真菌（直徑6 mm）接種在平板四周，于28℃培養(yǎng)6 d，根據(jù)抑菌圈的有無及大小判斷是否存在拮抗作用以及拮抗作用的強弱。

1．2．3．2 抑制菌絲生長法

將無菌濃縮液1 mL與9 mL融化的PDA培養(yǎng)基混勻，倒入無菌培養(yǎng)皿中制成帶藥培養(yǎng)基平板。培養(yǎng)基凝固后，放入1個供試菌的菌餅（直徑為6 mm），使菌餅帶菌絲的一面貼在培養(yǎng)基表面，重復(fù)3次。對照為取1 mL的無菌水與9 mL融化的PDA培養(yǎng)基混勻，其他操作同處理組一致。培養(yǎng)72～96 h后，按下列公式計算抑制率。

菌絲生長抑制率＝（對照菌落直徑－處理菌落直徑）／（對照菌落直徑－6）×100%。

1．2．3．3 抑制孢子萌發(fā)法

取供試植物病原真菌的孢子配成適當(dāng)濃度的孢子懸浮液，在10×10低倍鏡觀察，每個視野有30～40個孢子。將1 mL無菌濃縮液與1 mL孢子懸浮液混合，取1滴滴加在凹玻片上，每處理重復(fù)3次。對照為將1 mL的無菌水與1 mL孢子懸浮液混合，其他操作同處理組一致。在25℃下保濕培養(yǎng)，當(dāng)對照的萌發(fā)率達(dá)到80%后，檢查所有處理的萌發(fā)率。以孢子芽管長度大于孢子短半徑者為萌發(fā)。在小麥赤霉病菌孢子液中添加當(dāng)歸內(nèi)生真菌提取物后，培養(yǎng)至8 h，而其他3種病原真菌孢子的處理組均培養(yǎng)至10 h后，按下式計算孢子萌發(fā)抑制率：

萌發(fā)抑制率＝（對照萌發(fā)率－處理萌發(fā)率）／對照萌發(fā)率×100%。

2 結(jié)果與分析

2．1 拮抗菌株的初步篩選

將分離于當(dāng)歸新鮮植株的206株內(nèi)生真菌分別進(jìn)行對小麥赤霉病菌、番茄早疫病菌、番茄灰霉病菌和水稻紋枯病菌的拮抗試驗。結(jié)果表明，當(dāng)歸內(nèi)生真菌對小麥赤霉病菌和番茄早疫病菌的拮抗作用較為普遍，具有拮抗作用的內(nèi)生真菌比例分別達(dá)到24．3%和28．6%（表1）。

表1 當(dāng)歸內(nèi)生真菌對植物病原真菌的拮抗作用

2．2 當(dāng)歸內(nèi)生真菌代謝物對植物病原真菌菌絲生長及孢子萌發(fā)的抑制作用

采用菌絲生長速率法考察了部分有益內(nèi)生真菌代謝物對4種植物病原真菌菌絲生長的影響，結(jié)果表明，內(nèi)生真菌 Coccosporell a sp．、Coniosporieae sp．1、Fusell a sp．2和Fusell a sp．3代謝物對小麥赤霉病菌、番茄早疫病菌、番茄灰霉病菌以及水稻紋枯病菌生長的抑制作用最強，抑制率分別達(dá)到71．6%、62．8%、76．6%和60．7%；此外，Phacidium sp．代謝物對小麥赤霉病菌、番茄早疫病菌以及番茄灰霉病菌均具有較強的抑制活性，F(xiàn)usell a sp．2代謝物對番茄灰霉病菌和小麥赤霉病菌具有較強的抑制作用（表2）。

采用孢子萌發(fā)法考察了當(dāng)歸內(nèi)生真菌代謝物對4種植物病原真菌孢子萌發(fā)的影響，結(jié)果表明，對小麥赤霉病菌、番茄早疫病菌、番茄灰霉病菌以及水稻紋枯病菌孢子萌發(fā)具有抑制作用的內(nèi)生真菌比例均超過20%（表3）。其中，以小黏盤孢屬（Myxor mia）、暗梗梭孢霉屬（Coniosporieae）以及束絲孢屬（Ozoniu m）的內(nèi)生真菌數(shù)量較多。My xor mia sp．2和My xor mia sp．4代謝物對4種植物病原真菌孢子萌發(fā)的抑制率均達(dá)到90%以上，Coniosporieae sp．4、Coniosporieae sp．6 以及 My xor mia sp．7代謝物對小麥赤霉病菌、水稻紋枯病菌孢子萌發(fā)抑制作用較強，Coniosporieae sp．7代謝物對小麥赤霉病菌和番茄早疫病菌孢子萌發(fā)的抑制活性約為其他2種植物病原菌的一倍（表4）。

表3 抑制4種植物病原真菌孢子萌發(fā)的當(dāng)歸內(nèi)生真菌的篩選

表4 當(dāng)歸有益內(nèi)生真菌代謝物對植物病原真菌孢子萌發(fā)的抑制作用

2．3 部分有益內(nèi)生真菌發(fā)酵液活性部位的篩選

將發(fā)酵液經(jīng)過低溫真空濃縮至干，得到的干物質(zhì)分別采用不同極性的溶劑（石油醚、乙酸乙酯、50%乙醇、水）進(jìn)行提取，提取液濃縮至干，進(jìn)行活性檢測。結(jié)果表明，乙酸乙酯提取部位對植物病原真菌菌絲體和孢子萌發(fā)的抑制作用相對較強，表明在內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物中非極性、親酯性的活性物質(zhì)含量較多，但不同的提取部位對植物病原真菌菌絲生長及孢子萌發(fā)的整體抑制活性則大大減弱（表5，表6）。

表5 部分有益內(nèi)生真菌發(fā)酵液不同提取部位對病原真菌菌絲生長的抑制作用

表6 部分有益內(nèi)生真菌發(fā)酵液不同提取部位對病原真菌孢子萌發(fā)的抑制作用

3 討論

在內(nèi)生真菌與宿主植物構(gòu)成的微生態(tài)系統(tǒng)中，內(nèi)生真菌發(fā)揮著重要的生態(tài)學(xué)功能，對植物病原菌的抑菌、殺菌現(xiàn)象較為普遍［10－11］。80%的植物內(nèi)生真菌在抗真菌、抗藻類或抗雜草等方面具有較強的生物活性，而來自土壤中的真菌大約只有43%具有活性［12］。其抗菌活性主要是由于能夠產(chǎn)生多種多樣的抗菌物質(zhì)，一些內(nèi)生真菌產(chǎn)生的生物堿可增強宿主植物的抗病性，抑制病原菌的生長和孢子萌發(fā)等［13］。如從衛(wèi)矛科藥用植物雷公藤（Tripter ygeu m wil for dii Hook F．）中分離的內(nèi)生菌能產(chǎn)生一種新酰胺生物堿，該物質(zhì)對稻瘟病菌（Pyricul aria or yzae Cav．）及其他多種植物病原真菌具有較強的抑殺作用［14－15］。從 美 麗 決 明（Cassia spectabilis）的擬莖點霉屬內(nèi)生真菌Phomopsis cassiae中分離到5個杜松烷倍半萜，其中3，11，12－trihydroxycadalene對球孢枝孢（Cladosporium sphaerosper mum）和枝狀枝 孢 （C．cl adosporioides）的 抑 菌 活 性 最 強［16］。由此可見，在尋找新的天然藥物以及植物病蟲害的防治藥物方面，植物內(nèi)生真菌將是一個新的資源庫。在本研究中，多數(shù)當(dāng)歸內(nèi)生真菌對小麥赤霉病菌、番茄早疫病菌、番茄灰霉病菌以及水稻紋枯病菌等植物病原真菌具有較強的抑制活性，用不同極性溶劑進(jìn)行內(nèi)生真菌次生代謝物質(zhì)的提取，結(jié)果表明內(nèi)生真菌的活性物質(zhì)主要存在于乙酸乙酯提取部位。此外，雖然不同提取部位的活性出現(xiàn)了不同程度的降低，但不同提取部位都具有一定的抗菌和抑制植物病原真菌孢子萌發(fā)的活性。本研究表明抗植物病原真菌的當(dāng)歸內(nèi)生真菌種群具有多樣性，同時其產(chǎn)生的活性物質(zhì)也具有多樣性的特點，因此藥用植物內(nèi)生真菌有望成為生物農(nóng)藥研究與開發(fā)的新資源，在植物病蟲害生物防治中將具有較好的應(yīng)用前景，對于中藥材的栽培生產(chǎn)以及中藥資源可持續(xù)利用等方面都具有重要的實踐指導(dǎo)意義和理論價值。

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