高 芬， 盧賽飛， 王夢亮

（山西大學(xué)應(yīng)用化學(xué)研究所，太原 030006）

植物病原真菌是危害農(nóng)作物的主要病原微生物類群，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大的損失［1］。目前，化學(xué)農(nóng)藥在控制植物病害造成的損失上仍起著主要作用。但是化學(xué)農(nóng)藥的大量使用，已經(jīng)對人類環(huán)境造成了嚴(yán)重的危害，并且增加了病害的抗藥性［2］。從天然資源中尋找活性物質(zhì)代替化學(xué)農(nóng)藥和使用天然抗菌化合物保護作物已成為當(dāng)前研究的重點［3］。鏈霉菌182－2（Streptomyces sp．182－2）產(chǎn)生一種抗真菌抗生素，其發(fā)酵液具有較廣的抗菌譜，生物活性明確、高效，具有開發(fā)為工業(yè)化產(chǎn)品的價值，所以有必要對其進行分離純化。由于該抗菌活性組分具有水溶性好的特點，用一般的有機溶劑萃取的方法不能從發(fā)酵液中將其有效地提取出來［4］。而用大孔吸附樹脂提取抗生素多有報道，且此方法具有吸附容量大、吸附速度快、易解吸、易再生等優(yōu)點［5－6］，所以本試驗采用的方法為活性炭脫色、大孔吸附樹脂柱層析純化等方法對鏈霉菌182－2產(chǎn)生的抗真菌活性物質(zhì)進行了初步純化，并對其抑菌特性進行了初步研究。

1 材料與方法

1．1 材料

1.1.1 供試菌株

鏈霉菌182－2菌株由本實驗室保存；煙草赤星病菌［Alter naria alter nata （Fries）Keissler］由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所惠贈。

1．1．2 主要儀器和材料

儀器：DHL－A電腦恒流泵（上海青浦滬西儀器廠）。電腦自動部分收集器DBS－100（上海青浦滬西儀器廠）。HD－9704紫外檢測儀（上海精科實業(yè)有限公司）。

試劑：大孔吸附樹脂：X－5、H103、AB－8購自南開大學(xué)化工廠，XAD16、XAD7購自北京慧德易?；钚蕴浚嘿徸孕氯A活性炭廠。

1．2 發(fā)酵液的預(yù)處理

發(fā)酵液用草酸（0．5 mol／L）調(diào)p H3．0，60℃保溫30 min，然后6 000 r／min離心10 min沉降，取上清液加入等量預(yù)冷丙酮，混合均勻后，將混合液在水浴中緩緩加熱至50℃，維持10 min，冷卻至室溫，再次6 000 r／min離心10 min去除沉淀，上清旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去掉丙酮［4］。

1．3 抑菌活性測定方法

采用牛津杯法［7］。將活化的煙草赤星病菌制成孢子懸液（10×15倍下，10～20個／視野），吸取300μL加入70 mL熔融態(tài)PDA培養(yǎng)基，制成混菌平板。等距離放置牛津杯，用移液槍往每個牛津杯中加200μL粗提液，28℃恒溫培養(yǎng)48 h后十字交叉法測量抑菌圈直徑，下面所有抑菌試驗均設(shè)3次重復(fù)，以無菌蒸餾水為對照。

1．4 活性炭吸附法純化抗菌活性物質(zhì)

1．4．2 活性炭的篩選

稱取處理好的1．5 mm柱狀活性炭、4 mm柱狀活性炭、粉末狀活性炭和顆粒狀活性炭各1 g，放入三角瓶中，加預(yù)處理的發(fā)酵液4 mL，搖床上振搖4 h（220 r／min，28℃）。測吸附余液抑菌活性。

1．4．2 洗脫劑及濃度的選擇

取吸附后的1．5 mm柱狀活性炭平均分裝于4個三角瓶中，分別加入50%、60%和70%的丙酮，及80%乙醇各4 mL，搖床上振搖4 h（220 r／min，28℃）。測洗脫液抑菌活性。

1．4．3 1．5 mm柱狀活性炭純化抗菌活性物質(zhì)

依據(jù)上述試驗篩選的條件，取1．5 mm柱狀活性炭50 g，放入三角瓶中，加100 mL預(yù)處理的發(fā)酵液，搖床上振搖4 h（220 r／min，28℃）。吸附完后用等體積的50%的丙酮洗脫，搖床上振搖4 h（220 r／min，28℃）。測量洗脫液抑菌活性，并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，冷凍干燥。

1．4．4 活性炭脫色效果的測定

將經(jīng)活性炭處理過的抗菌活性物質(zhì)稀釋成不同濃度，在480 nm處測吸光值，對其進行線性回歸，得回歸方程y＝0．049 9x＋0．034 8，r2＝0．998 9，線性關(guān)系良好。于480 nm處測定粗提液吸收值，以吸光度值表示溶液色度的大小。依據(jù)公式：脫色率＝（脫色前色度－脫色后色度）／脫色前色度×100%，計算脫色率［8］。

1．5 大孔樹脂吸附法純化抗菌活性物質(zhì)

1．5．1 樹脂的篩選

取經(jīng)過預(yù)處理的大孔吸附樹脂H103、X－5、AB－8、XAD7、XAD16各1 g，放入三角瓶中，分別加入6 mL的2 mg／mL的粗提液，搖床上振搖4 h（220 r／min，28℃），測吸附余液活性。

1．5．2 洗脫劑的篩選

將吸附后的H103樹脂傾去余液，平均置于6個三角瓶中，加入50%、80%甲醇；50%、75%乙醇；50%、75%丙酮各6 mL，搖床上振搖4 h（220 r／min，28℃），測洗脫液抑菌活性。

1．5．3 洗脫流速對洗脫效果的影響

用吸附飽和的大孔吸附樹脂H103制備層析柱3根（2．0 c m×40 c m），然后用50%的丙酮160 mL洗脫，流速分別為1．0、1．5、2．0 mL／min，流出液每4 mL收集一管。分別測定各管收集液在254 n m下的紫外吸收值。

1．5．4 H103樹脂柱層析純化抗菌活性物質(zhì)

H103樹脂經(jīng)過預(yù)處理后裝柱（2．0 c m×40 c m），3倍體積去離子水平衡。上樣20 mL（濃度2 mg／mL），流速0．5 mL／min。上樣完畢，用去離子水80 mL快速沖洗未完全吸附的活性物質(zhì)后，50%的丙酮洗脫，洗脫體積160 mL，流速1．0 mL／min。分部收集洗脫液，4 mL／管。紫外吸收法和牛津杯法分別檢測每管洗脫液的紫外吸收和抑菌活性，并繪制洗脫曲線。合并同一洗脫峰中活性高的洗脫液，并將合并液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，冷凍干燥。

1．6 抗菌活性物質(zhì)對煙草赤星病菌的作用方式

1．6．1 對煙草赤星病菌的抑制作用

將煙草赤星病菌的孢子（10×15倍下，10～20個孢子每視野）制成混菌平板，混菌平板制作同1．3。分別加入經(jīng)H103樹脂純化后的活性物質(zhì)，使其終濃度分別為125、250、500、1 000μg／mL和2 000μg／mL，做抑菌活性測定，并在顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)變化。

1．6．2 對煙草赤星病菌的抗生作用

將300μL煙草赤星病菌孢子液（10×15倍下，10～20個孢子每視野）加入30 mL PD培養(yǎng)液中，28℃恒溫培養(yǎng)24 h至長出均勻可見菌絲后，將活性物質(zhì)加入培養(yǎng)液，使其終濃度分別為10、20、40、80、160μg／mL和320μg／mL。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，肉眼觀察未見菌絲生長的最低濃度為最小抑菌濃度（MIC）。然后將菌絲撈出，無菌水充分沖洗，重新放入未加活性物質(zhì)的PD培養(yǎng)液30 mL中，再培養(yǎng)48 h，肉眼觀察未見菌絲生長的最低濃度為最小殺菌濃度（MBC）［9］。

1．6．3 對煙草赤星病菌菌絲生長速率的影響

將活性物質(zhì)加入定量裝好的熔融態(tài)PDA培養(yǎng)基內(nèi)，使其終濃度為6．25、12．5、25、50、100μg／mL和200μg／mL，制成含毒平板，再將培養(yǎng)7 d的病菌制成菌餅（直徑6 mm），接入含毒平板中央，28℃恒溫培養(yǎng)。于24、48、72 h時十字交叉法測菌餅的生長情況。計算抑制率和抑菌中濃度（EC50）［10－11］。

1．6．4 對煙草赤星病菌孢子萌發(fā)的影響

將活性物質(zhì)分別配制成一定濃度溶液，取配好的藥液5 mL與孢子懸浮液（20～40個／視野）等體積混合后，使活性物質(zhì)終濃度分別為6．25、12．5、25、50、100μg／mL和200μg／mL，加入無菌平皿，28℃恒溫培養(yǎng)。24、48、72 h時觀察孢子萌發(fā)情況。拍照觀察孢子形態(tài)。計算孢子萌發(fā)抑制率和抑菌中濃度EC［10－11］50。

上述試驗均以無菌蒸餾水為對照，設(shè)3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2．1 發(fā)酵液的預(yù)處理

發(fā)酵液經(jīng)草酸酸化和丙酮沉淀兩步去除了雜蛋白和其他雜質(zhì)，牛津杯法測定抑菌活性后，抑菌圈直徑可達38．4 mm。

2．2 活性炭吸附法純化抗菌活性物質(zhì)條件的篩選

2．2．1 活性炭的篩選

吸附余液的抑菌試驗結(jié)果顯示：用1．5 mm柱狀活性炭處理后，吸附余液的抑菌圈直徑最小，用粉末狀活性炭處理后的吸附余液抑菌圈最大（圖1）。說明1．5 mm柱狀活性炭對該活性物質(zhì)的吸附能力最強。因此，選用1．5 mm柱狀活性炭進行下步試驗。

圖1 經(jīng)不同活性炭處理后吸附余液的抑菌活性

2．2．2 洗脫劑及濃度的選擇

洗脫劑的選擇結(jié)果如圖2所示，1．5 mm柱狀活性炭經(jīng)50%丙酮、60%丙酮和80%乙醇洗脫后，50%丙酮的洗脫液抑菌活性最強，可達35．0 mm。同時發(fā)現(xiàn)，50%丙酮的洗脫液顏色最淺，只有輕微的黃色，可見在這一洗脫條件下，抑菌活性物質(zhì)被較好地洗脫下來，而色素洗脫下來很少。

圖2 不同洗脫劑洗脫能力的對比

2．2．3 1．5 mm柱狀活性炭純化抗菌活性物質(zhì)

經(jīng)活性炭純化后的抗菌活性物質(zhì)，抑菌圈直徑可達到38 mm。且脫色效果明顯，未經(jīng)處理的活性物質(zhì)粗提液，顏色為深黃色，經(jīng)過處理的活性物質(zhì)液體較透明澄清，脫色率可達77%。

2．3 大孔樹脂吸附法純化抗菌活性物質(zhì)

2．3．1 樹脂的選擇

樹脂篩選結(jié)果如圖3所示，用H103樹脂處理過的吸附余液的剩余活性最小，而XAD7樹脂處理過的吸附余液活性最大，這說明H103對該活性物質(zhì)的吸附能力最強。因此，選用H103樹脂為試驗用的樹脂。

圖3 經(jīng)不同樹脂處理后吸附余液的抑菌活性

2．3．2 洗脫劑的選擇

大孔樹脂吸附活性物質(zhì)后，用不同溶劑系統(tǒng)洗脫，50%丙酮的洗脫液抑菌活性最大（圖4），說明該溶劑系統(tǒng)可以把活性物質(zhì)從樹脂上很好地洗脫下來，因此選擇50%丙酮作為大孔樹脂吸附后的洗脫劑。

圖4 不同洗脫劑洗脫能力的對比

2．3．3 洗脫流速對洗脫效果的影響

由圖5可知，洗脫流速對分離效果有一定的影響，洗脫流速為2 mL／min時，洗脫曲線峰形較寬，且伴隨一定程度的拖尾現(xiàn)象，不利于純化。當(dāng)流速為1 mL／min時，洗脫峰形最窄，洗脫成分相對集中，樣品較好地進行分離。所以本試驗選擇洗脫流速為1 mL／min。

圖5 洗脫流速對洗脫效果的影響

2．3．4 H103樹脂柱層析純化抗菌活性物質(zhì)

按上述選擇條件進行H103柱層析，以每管收集餾分的抑菌活性和在254 n m下的紫外吸收為檢測指標(biāo)，在50%丙酮洗脫下均得到2個洗脫峰（圖6），推測至少含有2個活性組分。由于洗脫峰Ⅰ抑菌活性小，且收集量較少，因此主要收集洗脫峰Ⅱ為下步研究對象。

圖6 大孔樹脂吸附法純化抗菌活性物質(zhì)的洗脫曲線

2．4 抗菌活性物質(zhì)對煙草赤星病菌的作用方式

2．4．1 對煙草赤星病菌的抑制作用

活性物質(zhì)的濃度為125μg／mL時，抑菌圈直徑只有13 mm，隨著其濃度的增大，抑菌圈直徑逐漸增大。當(dāng)活性物質(zhì)的濃度為2 000μg／mL時，對煙草赤星病菌的抑菌圈直徑可達58 mm。挑取這部分菌絲顯微觀察發(fā)現(xiàn)：菌絲顏色加深、節(jié)間縮短、變形扭曲并且產(chǎn)生大量泡囊，而對照菌絲生長光滑纖細(xì)（圖7）。

圖7 抗菌活性物質(zhì)對煙草赤星病菌的抑菌作用（400×）

2．4．2 對煙草赤星病菌的抗生作用

試驗結(jié)果表明，當(dāng)活性物質(zhì)濃度為80μg／mL時，24 h后菌絲未見生長。且隨著活性物質(zhì)濃度增大，變黑的菌絲逐漸增多。將不再生長的菌絲洗去黏附的抗菌活性物質(zhì)后，加入不含活性物質(zhì)的PD培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，活性物質(zhì)濃度為160μg／mL，處理過的菌絲沒有生長，所以該抗菌活性物質(zhì)的 MIC為80μg／mL，MBC為160μg／mL。

2．4．3 對煙草赤星病菌菌絲生長速率的影響

活性物質(zhì)對煙草赤星病菌菌絲生長有明顯的抑制作用。在相同時間下，抑菌作用隨活性物質(zhì)濃度的增大而增強；在同一濃度下，48 h時抑制率達到最高，EC50為31．9μg／mL。隨時間的延長，抑制率開始呈降低的趨勢（表1）。

表1 抗菌活性物質(zhì)對煙草赤星病菌菌絲生長速率的影響

2．4．4 對煙草赤星病菌孢子萌發(fā)的影響

抗菌活性物質(zhì)對煙草赤星病菌孢子萌發(fā)有明顯的抑制作用，在不同時間段內(nèi)，抑制率隨濃度的增大而增大；同一濃度下，48 h時抑制率達到最高，EC50為42．2μg／mL，之后開始下降（表2）。顯微鏡觀測顯示：對照的孢子光滑飽滿，萌發(fā)出光滑、細(xì)長的菌絲。處理的孢子則表面粗糙、甚至變形，萌發(fā)出的芽管受到了不同程度的抑制，有的剛萌發(fā)即形成大泡囊；當(dāng)活性物質(zhì)濃度為200μg／mL時，出現(xiàn)孢子破裂、原生質(zhì)體凝集滲漏現(xiàn)象（圖8）。

表2 抗菌活性物質(zhì)對煙草赤星病菌孢子萌發(fā)的抑制作用

圖8 抗菌活性物質(zhì)對煙草赤星病菌孢子萌發(fā)的抑制作用（400×）

3 結(jié)果與討論

鏈霉菌182－2發(fā)酵液中抗真菌活性組分的抗菌譜較廣，對煙草赤星、番茄早疫和蘋果斑點落葉等病原菌有明顯的抑制作用，具有較好的工業(yè)應(yīng)用價值。針對該抗菌活性物質(zhì)的理化性質(zhì)［12］，我們選擇了活性炭脫色法和大孔樹脂吸附法的粗分離［13－14］。結(jié)果表明1．5 mm 柱狀活性炭 具 有 較 好的脫色作用，且起到了一定的純化作用。H103大孔吸附樹脂對此活性物質(zhì)進行分離時，分離效果較好，去掉了大部分的雜質(zhì)，得到兩個活性峰，說明該抗菌活性物質(zhì)至少有兩個活性組分。由于活性峰Ⅰ抑菌活性較弱（這可能與收集到的量較少有關(guān)系），所以我們選擇活性峰Ⅱ收集，并進行抑菌作用方式的研究。

在離體條件下，采用抑制菌絲生長速率法和抑制孢子萌發(fā)等方法表明純化后的活性物質(zhì)對煙草赤星病原菌具有較強的抑制作用。對該抗菌物質(zhì)進一步純化以及結(jié)構(gòu)的研究正在進行中，相信該抗菌活性物質(zhì)會有很好的發(fā)展前景。

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