汪 劍,袁斌斌,布艾加爾·哈斯木

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京明基醫(yī)院心內(nèi)科,江蘇南京,210019)

原發(fā)性高血壓的是一種常見病[1],其發(fā)病與遺傳基因、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、血管內(nèi)皮功能紊亂等有關(guān),但確切的病因尚未知。miRNA是一種長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼、單鏈小RNA,在動(dòng)物種系發(fā)生中具有保守序列,在基因表達(dá)調(diào)控上發(fā)揮重要作用[2]。miR2 NA具有組織特異性,在所有的 miRNA中, miR126是內(nèi)皮特異性的miRNA,它能促進(jìn)血管生成,維持血管的完整性等[3]。有研究表明,在高血壓的患者中血清炎性因子的表達(dá)明顯上調(diào)[4]。同時(shí)在高血壓的患者中 miR-126高表達(dá),而在正常人群中低表達(dá)[5]。本研究擬想通過RNAi技術(shù)來(lái)下調(diào)miR126起到治療高血壓的作用。通過構(gòu)建慢病毒-下調(diào)miR-126載體,轉(zhuǎn)染至大鼠中,通過每周測(cè)量收縮壓(SBP)、舒張(DBP)、平均動(dòng)脈壓(MAP)、心率(HR)等,并且測(cè)定血清NO等含量,來(lái)研究miR-126是否有治療高血壓的作用。

1 材料與方法

1.1 慢病毒載體的構(gòu)建(lenti-miR-126-KD)

采用人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的慢病毒載體。其載體有2種真核表達(dá)啟動(dòng)子,啟動(dòng)子為CMV和 U6。在 U6啟動(dòng)子后的AgeI和EcoRI為限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)。NEB Buffer 1為緩沖液,所有限制酶反應(yīng)在37℃下進(jìn)行2 h?？寺≡O(shè)計(jì)的原理圖:Mo-mir-126 ripe rank:> rno-miR-126 MIMAT0000832 UCGUACCGU2 GAGUAA UAAUGCG。下調(diào)設(shè)計(jì)的原理圖:利用U6啟動(dòng)子來(lái)表達(dá)靶基因片段,如下: MS2117-1 CCGGCGCATTATTACTCACGGT ACGATTTTTTG MS2117-2 AATTCAAAAAATCGTACCGTGA GTAATAATGCG

1.2 動(dòng)物和分組

根據(jù)需求應(yīng)用PBS緩沖液將慢病毒載體稀釋為350μL,從大鼠的尾靜脈射入。24只8周齡自發(fā)性高血壓雄鼠隨機(jī)分成以下4組(每組6只):①高劑量組(HD):每只大鼠注射LentimiR-126-KD 1×108;②低劑量組(LD):每只大鼠注射Lenti-miR-126-KD 1×05;③空載組(Scramblemir):每只大鼠注射Lenti-Scram2 blemir 5×107;④對(duì)照組:每只大鼠僅注射PBS。

1.3 方法

1.3.1 血壓、心率和體重:應(yīng)用 Softron BP-98A大鼠尾中動(dòng)脈非侵入性的血壓儀,在大鼠清醒狀態(tài)和安靜環(huán)境下,測(cè)量大鼠的尾中動(dòng)脈SBP, MAP,DBP和HR,每次測(cè)量均在同一時(shí)間點(diǎn),每只大鼠均連續(xù)測(cè)量至少3次,取平均值。連續(xù)觀察8周以獲取相關(guān)資料。分別記錄試驗(yàn)前和試驗(yàn)8周后的大鼠體重。

1.3.2 免疫熒光染色:取大鼠心、肝、肺、腎臟和腦組織,將各組織進(jìn)行固定、沉積、速凍、切片。將切片置于顯微鏡載物玻璃片容器上,加50%蔗糖,蓋上蓋玻片,在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白,以得知慢病毒載體在體內(nèi)分布情況,觀察各組中綠色熒光蛋白表達(dá)的區(qū)別,同時(shí)鑒別轉(zhuǎn)染是否成功。

1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)測(cè)定:利用3%戊巴比妥鈉(0.2 g/100 g)將大鼠麻醉,開胸,用注射器從心尖取5 mL血,室溫下以轉(zhuǎn)速3 000 r/ min離心 15 min獲得血清標(biāo)本。一氧化氮(NO)、白蛋白(ALB)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AL T)、膽固醇(CHOL)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、甘油三酯(TG)、血尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)及鈉、鉀、鈣等含量用ELISA法測(cè)定。

2 結(jié) 果

2.1 lenti-miR-126-KD的構(gòu)建

下調(diào)miR-126 DNA的測(cè)序結(jié)果見圖1,高亮區(qū)顯示與成熟 miR-126 5′CGCATTAT2 TACTCACGGTACGA3′完全互補(bǔ)的反義序列。這表明慢病毒載體建立成功,病毒滴度為2×1010TU/mL。

圖1 lenti-miR-126-KD的DNA測(cè)序結(jié)果高光區(qū)域?yàn)閙iR-126的反義核苷酸序列: A.MS2117-1;B.MS2117-2

2.2 血壓和心率

如表1～表4和圖2所示,收縮壓,舒張壓和心率在試驗(yàn)前和試驗(yàn)后8周中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P >0.05)。無(wú)論處理或不處理,無(wú)論藥物劑量的大小均無(wú)顯著影響。經(jīng)過處理后4周,HD組和LD組與對(duì)照組相比,心率有下降趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

2.3 綠色免疫熒光蛋白染色

慢病毒載體沒有明顯的嗜組織性。綠色熒光在每個(gè)組織中的表達(dá),如圖3。所有組織在每一組顯示綠色熒光,其腦組織中分布較少,多在肺組織。

2.4 一氧化氮和生化指標(biāo)

一氧化氮和生化指標(biāo)如AST、AL T、ALB、CHOL、HDL-C、TG、BUN、CREA、鈉、鉀、鈣等,各組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表5。

表1 收縮壓的時(shí)間依賴性(±s,mmHg)

表1 收縮壓的時(shí)間依賴性(±s,mmHg)

時(shí)間 HD(n=6) LD(n=6) Scramblemir(n=6) 對(duì)照組(n=6) P value Pre-administer 167.32±8.83 166.67±7.54 162.62±9.31 164.95±9.48 0.809 1stweek 174.80±3.12 177.86±4.31 175.97±4.32 180.22±6.77 0.364 2ndweek 186.98±5.34 187.71±5.30 182.16±4.42 182.22±5.45 0.163 3rdweek 189.86±7.73 185.07±6.96 187.94±7.21 190.28±8.99 0.667 4thweek 179.83±7.06 184.62±8.93 187.75±5.65 185.44±8.20 0.469 5thweek 180.08±7.18 178.39±12.39 184.60±7.69 188.14±6.24 0.268 6thweek 187.35±12.50 192.85±8.44 186.06±10.89 189.71±12.53 0.740 7thweek 193.25±8.39 187.54±8.11 190.06±4.51 187.58±7.01 0.570 8thweek 182.88±5.33 189.17±7.12 183.65±4.29 185.50±8.03 0.405

表2 平均動(dòng)脈壓的時(shí)間依賴性(±s,mmHg)

表2 平均動(dòng)脈壓的時(shí)間依賴性(±s,mmHg)

(3Kruskal-Wallis nonparameter test)

時(shí)間 HD(n=6) LD(n=6) Scramblemir(n=6) 對(duì)照組(n=6) P Pre-administer 143.43±9.95 140.28±10.55 135.29±6.85 139.30±8.50 0.527 1stweek 145.44±9.21 144.39±6.91 144.18±9.10 147.04±8.45 0.926 2ndweek3 155.88±13.62 152.46±6.71 150.15±3.69 152.32±5.05 0.6983 3rdweek 163.25±10.85 155.92±8.50 160.70±6.22 162.52±9.73 0.520 4thweek 151.25±7.26 160.12±7.76 159.64±8.63 158.69±14.95 0.563 5thweek 153.60±5.56 161.94±8.41 155.68±7.46 164.25±12.27 0.221 6thweek 162.29±7.82 167.37±5.67 159.58±6.69 162.80±10.35 0.409 7thweek 156.58±5.30 157.74±4.58 158.00±10.34 157.04±9.84 0.992 8thweek 150.40±4.75 161.25±9.47 154.18±6.64 154.74±6.65 0.182

表3 舒張壓的時(shí)間依賴性(±s,mmHg)

表3 舒張壓的時(shí)間依賴性(±s,mmHg)

時(shí)間 HD(n=6) LD(n=6) Scramblemir(n=6) 對(duì)照組(n=6) P Pre-administer 131.4±10.63 127.06±12.59 121.10±13.02 127.08±13.22 0.599 1stweek 130.83±9.67 128.31±8.00 129.44±8.77 130.88±9.58 0.956 2ndweek 139.33±11.17 134.86±10.17 134.64±7.82 137.45±8.58 0.837 3rdweek 150.33±11.18 140.19±8.99 146.92±7.55 146.70±11.23 0.415 4thweek 137.75±6.93 147.73±11.11 145.83±8.40 145.48±13.95 0.539 5thweek 140.08±6.71 152.90±11.04 141.96±6.11 152.01±12.89 0.103 6thweek 150.31±9.33 153.72±7.32 146.22±12.24 149.62±13.19 0.704 7thweek 138.58±7.60 143.67±6.14 141.72±5.95 142.00±12.82 0.8293 8thweek 134.08±10.22 146.76±7.80 139.44±9.58 138.86±14.16 0.332

表4 心率的時(shí)間依賴性(±s,mmHg)

表4 心率的時(shí)間依賴性(±s,mmHg)

時(shí)間 HD(n=6) LD(n=6) Scramblemir(n=6) 對(duì)照組(n=6) P Pre-administer 425.07±56.25 399.28±30.59 412.91±30.54 425.07±56.25 0.705 1stweek 389.52±33.68 400.97±62.05 403.62±37.63 389.52±33.68 0.974 2ndweek 397.88±36.72 409.52±91.75 398.48±58.01 397.88±36.72 0.973 3rdweek 419.91±40.97 407.85±23.48 440.32±59.09 419.91±40.97 0.538 4thweek 378.84±27.79 412.23±44.57 437.79±68.45 378.84±27.79 0.105 5thweek 400.67±38.67 417.57±50.22 450.89±53.38 400.67±38.67 0.405 6thweek 419.62±45.17 422.95±41.81 457.44±86.22 419.62±45.17 0.365 7thweek 391.58±52.02 401.56±51.51 473.94±47.49 391.58±52.02 0.111 8thweek 392.62±13.94 413.52±65.57 423.39±72.69 392.62±13.94 0.178

3 討 論

慢病毒載體是一種復(fù)制缺陷的反轉(zhuǎn)錄病毒載體,本研究中我們采用慢病毒作為下調(diào)miR-126的載體,其含有兩個(gè)啟動(dòng)子,一個(gè)是CMV啟動(dòng)子,它促進(jìn)綠色免疫熒光蛋白基因的表達(dá)。另一個(gè)是U6啟動(dòng)子,在它的下游插入與mir-126互補(bǔ)的靶基因片段 ,從而使基因下調(diào)。如圖1所示 ,構(gòu)建載體后成功測(cè)序。病毒載體轉(zhuǎn)染八周后,在自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)心臟、腎臟、肝臟、腦及肺的組織切片檢測(cè)到綠色熒光,如圖4所示。這表明慢病毒轉(zhuǎn)染成功,并且在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)在SHR中仍有可確定的密度。原發(fā)性高血壓的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜,有文獻(xiàn)推測(cè)炎癥和免疫反應(yīng)可能是重要的機(jī)制之一。Liu等[6]檢測(cè)到miR-126可以在細(xì)胞和系統(tǒng)水平下調(diào)VEGF的表達(dá),亦有研究表明,miR-126在高血壓患者中高表達(dá)。因此我們擬想miR-126可能會(huì)減少內(nèi)源性VEGF的表達(dá),從而導(dǎo)致高血壓的發(fā)生。遺憾的是,本試驗(yàn)并未取得預(yù)期的結(jié)果。經(jīng)過8周觀察,與 Scram2 blemir及對(duì)照組相比較,并未發(fā)現(xiàn)血壓下降,NO及其他生化指標(biāo),心率等亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖2 SBP、MAP、DBP和HR分析

圖3 綠色免疫熒光蛋白的表達(dá)A.腦組織;B.肝臟組織;C.肺組織; D1.心肌縱向切面;D2.心肌橫向切面; E1.應(yīng)用低功率透鏡觀察的腎臟組織; E2.應(yīng)用高功率透鏡觀察的腎臟組織

下調(diào)miR-126的表達(dá)并未達(dá)到降壓的目的。推測(cè)有四種可能:①目前對(duì)miR-126的功能研究基于體外研究,很少進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn),利用慢病毒作為治療高血壓的載體基因的體內(nèi)研究是非常有限的,尚未確定是否需要重復(fù)處理[7]。在本研究中,注射八周后觀察到綠色熒光,本研究可以確定慢病毒載體相關(guān)濃度可以被檢測(cè)到,但不能證實(shí)已達(dá)到治療濃度,且也不能確認(rèn)miR-126表達(dá)是否成功下調(diào)。應(yīng)該進(jìn)一步采用 Westen-blot, RT-PCR和基因芯片等技術(shù)檢查SHR大鼠中miR-126的濃度,獲得各組miR-126的表達(dá)差異和濃度梯度,由此來(lái)確認(rèn)處理是否合理;②觀察時(shí)間:慢病毒載體的基因治療反應(yīng)慢、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)[8],本研究中每周觀察1次,這個(gè)方法是否合理仍需進(jìn)一步研究;③大鼠與人類的差異:本研究是以高血壓患者與健康人之間的顯著差異性為基礎(chǔ)的,畢竟人和大鼠在基因組學(xué)、遺傳學(xué)、生理學(xué)等各方面都有顯著偏差,其基因表達(dá)程度,激活機(jī)制和功能都可能不一致;④miR-126表達(dá)可能僅僅是高血壓的一個(gè)代償機(jī)制。本研究推測(cè)在高血壓患者中,內(nèi)皮功能損傷,炎癥反應(yīng)被激活, miR-126表達(dá)代償性增高,一方面它可以激活VEGF信號(hào)通路,促進(jìn)內(nèi)皮增生和損傷的細(xì)胞修復(fù),抑制血管增厚,改善血管重構(gòu)[9];另一方面,激活的VEGF通路可以促進(jìn)eNOS產(chǎn)生NO,逆轉(zhuǎn)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)紊亂[10]。

表5 一氧化氮和生化指標(biāo)(±s)

表5 一氧化氮和生化指標(biāo)(±s)

指標(biāo) HD(n=4) LD(n=5) Scramblemir(n=5) 對(duì)照組(n=5) P NO(μmol/L) 8.30±5.00 8.08±6.35 14.00±10.01 4.49±2.06 0.233 ALB(g/L) 16.02±1.74 16.62±1.45 17.15±1.72 18.62±0.57 0.131 CHOL(mmol/L) 1.74±0.32 1.59±0.06 1.69±0.12 1.64±0.05 0.552 LDL-C(mmol/L) 0.22±0.14 0.14±0.12 0.15±0.10 0.06±0.04 0.280 TG(mmol/L) 0.27±0.07 0.22±0.09 0.28±0.32 0.29±0.10 0.601 AST(U/L) 311.03±56.75 213.84±63.46 244.84±119.86 205.04±165.65 0.610 ALT(U/L) 59.37±8.66 57.67±8.96 61.47±13.63 65.32±9.18 0.764 BUN(mmol/L) 8.44±1.20 7.67±1.30 7.09±1.27 6.75±1.57 0.398 CREA(umol/L) 41.13±4.77 36.76±11.97 29.97±3.96 34.47±3.36 0.244 Na+(mmol/L) 146.27±2.21 147.93±1.32 147.37±1.46 146.36±1.86 0.422 K+(mmol/L) 6.86±1.07 6.07±0.63 6.75±0.53 6.66±0.71 0.250 Ca2+(mmol/L) 2.42±0.04 2.40±0.12 2.42±0.11 2.40±0.06 0.976

綜上所述,下調(diào)miR-126在抗高血壓治療方面無(wú)顯著性意義,高血壓患者中miR-126水平的高表達(dá)可能是由于代償機(jī)制[11-14]。但是,本研究有一定的局限性,需要進(jìn)一步的研究來(lái)揭開其中的潛在機(jī)制。

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