劉 靜,朱 琰,史 勤,呂 祥,馮彥軍

(1.上海市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科,上海,200071;2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院藥劑科,上海,200021)

我國大腸癌發(fā)病率和病死率在惡性腫瘤中占第5位[1],而在上海等大城市已成為繼肺癌之后的第二位高發(fā)腫瘤。由于各種原因,我國大腸癌的患者以進(jìn)展期居多,而目前進(jìn)展期大腸癌術(shù)后仍有近50%的患者發(fā)生復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移,5年生存率僅為40%～50%[2]。祖國醫(yī)學(xué)中,健脾益氣法是大腸癌防治工作中重要的手段之一[3]。本研究通過觀察健脾復(fù)方對人大腸癌原位移植瘤裸小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡的影響,來探討健脾復(fù)方對大腸癌發(fā)生發(fā)展的抑制作用,并研究其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本次研究由中科院上海實驗動物中心提供53只BALB/C裸小鼠,雌雄不限,無特定病原體(SPF)級,4～6周齡,體重18～20 g,并在上海中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗室(許可證號:SYXK[滬]2004 -2005)進(jìn)行飼養(yǎng),按SPF級要求,并進(jìn)行自由飲食。

1.2 造模

1.2.1 制備原位移植瘤塊:取3只BALB/C裸小鼠,對數(shù)生長期的大腸癌HT-29細(xì)胞(由上海市腫瘤研究所提供)制備成單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度至8×107/mL,右側(cè)腋下皮下注射,劑量為0.1 mL/只,連續(xù)觀察28 d,直至皮下瘤直徑達(dá)1 cm時將裸小鼠處死,并切下瘤塊,將壞死部分去除,分理出其中淡黃色或呈魚肉狀的瘤塊,置于生理鹽水中,再剪成直徑為2 mm的小瘤塊備用。1.2.2 制作原位移植瘤模型[4]:將40只BALB/ C裸小鼠術(shù)前禁食12 h,氯胺酮腹腔內(nèi)麻醉,仰臥固定,以下腹正中切口打開腹腔,用手術(shù)刀在距盲腸末端1 cm處腸系膜側(cè)的漿膜面輕輕刮傷漿膜層,再將直徑為2 mm的小瘤塊用OB膠黏附在裸小鼠腸壁上,以無損傷縫線全層縫合,檢查無活動性出血后關(guān)腹。術(shù)后所有裸小鼠暫時分籠飼養(yǎng)至完全清醒。整個手術(shù)過程在切除皮下瘤后1 h內(nèi)完成。另10只裸鼠行假手術(shù)后作為正常對照組。

1.3 藥物制備

1.3.1 健脾復(fù)方的制備:由上海市中醫(yī)醫(yī)院制劑室協(xié)助制備。健脾復(fù)方的藥物比例為:黃芪30 g,黨參12 g,炒白術(shù)12 g,茯苓12 g,半夏9 g,天龍6 g,紅藤30 g,藤梨根30 g,生牡蠣30 g,炙甘草6 g。根據(jù)該處方比例,取生藥900 g,濃煎至300 mL,含生藥3 g/mL。

1.3.2 塞來昔布溶液制備:將塞來昔布膠囊(商品名:西樂葆,輝瑞制藥有限公司生產(chǎn))磨粉,用無菌蒸餾水溶解,每mL含塞來昔布1.33 mg,由上海市中醫(yī)醫(yī)院制劑室協(xié)助制備。

1.3.3 5-氟尿嘧啶(5-Fu)注射液:由上海旭東海普制藥有限公司生產(chǎn),規(guī)格為10mL∶0.25g。

1.4 分組與給藥方案

將53只BALB/C裸小鼠隨機分為5組:健脾復(fù)方組、塞來昔布組、5-Fu組、模型對照組和空白對照組,每組10只。健脾復(fù)方組予健脾復(fù)方灌胃(0.5 mL/次,1次/d)+生理鹽水腹腔注射(1 mg/次,1次/周)。塞來昔布組予塞來昔布溶液灌胃(0.5 mL/次,1次/d)+生理鹽水腹腔注射(1 mg/次,1次/周)。5-Fu組予生理鹽水灌胃(0.5 mL/次,1次/d)+5-Fu腹腔注射(1 mg/次,1次/周)。模型對照組予生理鹽水灌胃(0.5 mL/次,1次/d)+生理鹽水腹腔注射(1 mg/次,1次/周)。正常對照組予生理鹽水灌胃(0.5 mL/次,1次/d)+生理鹽水腹腔注射(1 mg/次,1次/周)。5組均于成功造模后第2天開始給藥,共8周。所有實驗動物均給予飼料餅喂養(yǎng),并自由飲用消毒水。

1.5 標(biāo)本處理

5組裸小鼠均于成功造模后8周處死,之后立即將腹腔打開,并將腫瘤組織取出。取小塊腫瘤組織立即-80℃液氮保存,其余組織(空白對照組取腸組織)采用10%甲醛溶液固定,并酒精梯度脫水、石蠟包埋后,切片厚度約6μm,再用蘇木精染色,最后送病理科。

1.6 指標(biāo)檢測方法

免疫組化法檢測信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子-3(Stat-3)、B細(xì)胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)、存活素(Survivin)、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3、Cas2 pase-8和Caspase-9的表達(dá),試劑由 SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY,INC提供,嚴(yán)格根據(jù)說明書進(jìn)行檢測。

表1 免疫組化法檢測各組裸小鼠凋亡因子表達(dá)結(jié)果(n=10,±s,ng/L)

表1 免疫組化法檢測各組裸小鼠凋亡因子表達(dá)結(jié)果(n=10,±s,ng/L)

3采用廣義線性模型進(jìn)行組間比較;采用LSD法與模型對照組比較,##P<0.01;采用LSD法與塞來昔布組比較,△P<0.05,△△P<0.01;采用LSD法與5-Fu組比較,▲P<0.05,▲▲P<0.01;采用LSD法與空白對照組比較,☆☆P<0.01

指標(biāo) 健脾復(fù)方組 5-Fu組 塞來昔布組 模型對照組 空白對照組 P值3 Stat-3 0.14±0.02## 0.17±0.03 0.15±0.03## 0.23±0.03 0.14±0.07## 0.0389 Survivin 0.12±0.04△▲▲ 0.18±0.02 0.16±0.03 0.15±0.03▲ 0.10±0.03##△△▲▲ 0.0050 Bcl-2 0.11±0.03##▲▲ 0.18±0.03☆☆ 0.13±0.03▲▲☆☆ 0.15±0.03 0.09±0.02## 0.0006 Caspase-9 21.22±7.01##▲▲ 11.48±4.98 23.96±6.22##▲▲ 9.36±2.65 20.58±13.76##▲▲ 0.0012 Caspase-8 17.69±11.77## 11.41±2.61##△△ 19.27±6.85## 3.12±1.20 8.54±4.80△△ 0.0005 Caspase-3 18.60±11.45## 10.68±3.27 14.61±4.68 5.91±3.27 20.44±18.16## 0.0071

2 結(jié) 果

2.1 Stat-3的表達(dá)

5組裸小鼠腸組織的Stat-3表達(dá)見表1。經(jīng)廣義線性模型檢驗,F=10.09,P=0.0389。經(jīng)LSD法兩兩比較,健脾復(fù)方組、塞來昔布組和空白對照組Stat-3表達(dá)顯著低于模型對照組(P<0.01)。

2.2 Survivin的表達(dá)

5組裸小鼠腸組織的Survivin表達(dá)見表1。經(jīng)廣義線性模型檢驗,F=14.86,P=0.0050。經(jīng)LSD法兩兩比較,健脾復(fù)方組和空白對照組Survivin表達(dá)低于5-Fu組、塞來昔布組;空白對照組Survivin表達(dá)低于模型對照組(P<0.05或P<0.01)。

2.3 Bcl-2的表達(dá)

5組裸小鼠腸組織的Bcl-2表達(dá)見表1。經(jīng)廣義線性模型檢驗,F=19.76,P=0.0006。經(jīng)LSD法兩兩比較,健脾復(fù)方組、塞來昔布組和空白對照組Bcl-2表達(dá)低于模型對照組;健脾復(fù)方組、塞來昔布組Bcl-2表達(dá)低于5-Fu組;5-Fu組和塞來昔布組Bcl-2表達(dá)高于空白對照組(P<0.01)。

2.4 Caspase-9、Caspase-8和Caspase-3的表達(dá)

5組裸小鼠腸組織的Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9表達(dá)見表1。Caspase-9的表達(dá)經(jīng)廣義線性模型檢驗,F=18.13,P=0.0012。經(jīng)LSD法兩兩比較,健脾復(fù)方組、塞來昔布組和空白對照組Caspase-9表達(dá)高于模型對照組和5-Fu組(P<0.01)。Caspase-8的表達(dá)經(jīng)廣義線性模型檢驗,F=20.00,P=0.0005。經(jīng)LSD法兩兩比較,健脾復(fù)方組、塞來昔布組和5-Fu組Caspase-8表達(dá)高于模型對照組;塞來昔布組的Caspase-8表達(dá)高于5-Fu組和空白對照組(P <0.01)。Caspase-3的表達(dá)經(jīng)廣義線性模型檢驗,F=14.06,P=0.0071。經(jīng)LSD法兩兩比較,健脾復(fù)方組、空白對照組Caspase-3表達(dá)高于模型對照組(P<0.01)。

2.5 病理結(jié)果

健脾復(fù)方組、塞來昔布組、5-Fu組、模型對照組各裸小鼠取得的瘤塊組織均為低至中度分化腺癌,癌細(xì)胞異型性明顯,多呈實體狀排列,部分呈腺樣排列,腫瘤間質(zhì)少,均有不同程度的腫瘤組織壞死和炎細(xì)胞浸潤。

3 討 論

臨床研究提示健脾復(fù)方聯(lián)合化療在大腸癌術(shù)后患者中顯示了一定的療效,不僅能夠改善患者的臨床癥狀,減少不良反應(yīng),而且能夠提高患者生存率[5-9]。細(xì)胞凋亡異常是腫瘤發(fā)生發(fā)展的主要因素,那么健脾復(fù)方是否也能通過對細(xì)胞凋亡的調(diào)控,從而影響到大腸癌的發(fā)展呢?已有報道[10]通過胃癌移植瘤裸小鼠模型,顯示健脾方藥活化Caspase-9和Casepase-3,實現(xiàn)體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,其機制與下調(diào)Stat-3和Bcl-2的表達(dá)、抑制 P-Stat-3和Bcl-2在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)有關(guān),但是很少有研究探討健脾中藥對大腸癌細(xì)胞凋亡的影響。

這些基因中既可能單獨調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡,也可相互影響,相互作用。Stat-3是轉(zhuǎn)錄信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與激活子家族的重要成員,通過激活下游癌基因,使抑癌基因失活,從而改變細(xì)胞周期進(jìn)程,阻斷細(xì)胞凋亡,使腫瘤獲得不斷增殖的能力。Stat -3下游目的基因包括Bcl-2和Survivin。Sur2 vivin是處于細(xì)胞增殖與細(xì)胞死亡界面的分子,通過內(nèi)源性及外源性途徑最終作用于天冬氨酸特異性蛋白酶(Caspases)家族,抑制細(xì)胞凋亡[11]。Bcl-2也可阻斷細(xì)胞色素c從線粒體釋放,從而影響Caspase家族抑制細(xì)胞凋亡。含有半胱氨酸的Caspases是近年來發(fā)現(xiàn)的一組存在于胞質(zhì)溶膠中的結(jié)構(gòu)上相關(guān)的半胱氨酸蛋白酶,現(xiàn)已確定至少存在11種Caspase,Caspase家族又可分為起始Caspase和執(zhí)行 Caspase,其中 Caspase-8和Caspase-9參與細(xì)胞凋亡的起始;Caspase-7參與細(xì)胞凋亡的執(zhí)行。在凋亡信號的作用下,細(xì)胞色素c從線粒體釋放出來,激活Caspase-9前體轉(zhuǎn)變成Caspase-9,后者再激活Caspase-3,激活的Caspases引起DNA斷裂和細(xì)胞骨架成分降解。

研究發(fā)現(xiàn)塞來昔布可抑制結(jié)腸癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移,促進(jìn)細(xì)胞凋亡等作用[12],因而塞來昔布對大腸癌的治療作用也被廣泛研究。本研究也將其作為對照組之一,結(jié)果顯示塞來昔布對大腸癌細(xì)胞凋亡有一定的調(diào)控能力,與文獻(xiàn)報道[12]一致。

本研究結(jié)果顯示,大腸癌組織中Stat-3、 Bcl-2、Survivin和Caspase-9、Caspase-8、Cas2 pase-3的表達(dá)均異常,證實了在大腸癌中存在細(xì)胞凋亡的異常。健脾復(fù)方能下調(diào)Stat-3、Bcl-2的表達(dá),上調(diào)Caspase-9、Caspase-8、Caspase-3的表達(dá),最終促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。這些結(jié)果提示了健脾復(fù)方抑制大腸癌發(fā)展的作用途徑之一是抑制大腸癌的細(xì)胞凋亡[13-14]。健脾復(fù)方對于凋亡因子的調(diào)控也有優(yōu)于其他治療組的趨勢。但本研究仍有不確定的結(jié)果,例如健脾復(fù)方對于Sur2 vivin的調(diào)節(jié)作用有待于進(jìn)一步的實驗進(jìn)行確定。

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