王端明，王敬晗，李林芳，陳靜波，蘇長青

1 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院 新疆地方與民族高發(fā)病實驗室，新疆 石河子 832000

2 第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院 分子腫瘤研究室，上海 200438

3 新疆畜牧科學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830000

原發(fā)性肝癌是最常見的致死性惡性腫瘤，預(yù)后差，多數(shù)患者在首次手術(shù)后一年內(nèi)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，一年生存率極低[1]。而我國又是乙型肝炎感染人群最多的國家，肝癌的發(fā)病率明顯較其他國家偏高[2-3]。因此，深入了解肝癌發(fā)病的分子機(jī)制并積極探索新的治療手段是提高肝癌整體治療效果的關(guān)鍵。腫瘤細(xì)胞具有較強的凋亡抗性，并在一定程度上具有干細(xì)胞特性，是腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的重要原因之一。Survivin是近年來克隆出的凋亡抑制蛋白家族 (IAPs) 新成員之一，也是迄今為止發(fā)現(xiàn)的抑制凋亡作用最強的凋亡抑制因子[4]。正常情況下僅表達(dá)于胚胎組織，在胚胎發(fā)育和細(xì)胞分化中起著調(diào)控細(xì)胞有絲分裂、抑制細(xì)胞凋亡的重要作用[5]。目前研究發(fā)現(xiàn) Survivin在絕大多數(shù)腫瘤組織中高表達(dá)，提示Survivin與腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在極為密切的關(guān)系[6-7]。Survivin抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制還有許多尚待解決的疑難問題[8-9]。其中，Survivin與其他調(diào)控因子的相互作用尤為值得注意。Oct-4屬于POU轉(zhuǎn)錄因子家族，是一類DNA結(jié)合蛋白，能夠激活在啟動子或增強子區(qū)域內(nèi)帶有順式作用元件的基因轉(zhuǎn)錄，對維持和調(diào)節(jié)干細(xì)胞狀態(tài)起著關(guān)鍵作用。已有研究表明，很多類型的腫瘤細(xì)胞也有高水平的Oct-4表達(dá)，可能是參與了腫瘤細(xì)胞的自我更新[10]。鑒于此，本研究將應(yīng)用分子克隆和同源重組技術(shù)構(gòu)建特異性針對 Oct-4和Survivin基因的雙靶向shRNA腺病毒載體，并觀察其對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，通過裸鼠荷瘤實驗檢驗其抗腫瘤能力，旨在優(yōu)化腫瘤基因治療的方法，尋求更為有效的治療策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

胎牛血清購自PAA公司，DMEM粉劑購自Gibco公司，各種限制性內(nèi)切酶均購自 NEB公司，質(zhì)粒提取試劑盒、病毒基因組提取試劑盒QIAGEN DNA Blood Mini Kit購自QIAGEN公司，膠回收試劑盒購自MN公司，鼠抗人Oct-4單抗購自美國Santa Cruz公司，兔抗人Survivin多抗購自美國R&D生物公司，山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG、雙染SP試劑盒購自福州邁心生物技術(shù)公司，細(xì)胞裂解蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自 Pierce公司，預(yù)染蛋白 Marker購自 Fermentas公司，轉(zhuǎn)染試劑LipoFectamine2000試劑盒購自Invitrogen公司，其余試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.1.2 菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞株

大腸桿菌菌株 DH5α、重組腺病毒質(zhì)粒pAd-EGFP、肝癌細(xì)胞系EHBH-H1由第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院實驗室保存，腺病毒包裝用HEK293細(xì)胞株購自美國ATCC。

1.1.3 實驗動物

清潔級BALB/c裸鼠30只，4周齡，體重16~18 g，由中國科學(xué)院上海實驗動物中心提供，合格證號SCXK (滬) 2009-0003。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞系EHBH-H1用含10%胎牛血清、100 IU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃飽和濕度及5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待生長細(xì)胞達(dá)到80%以上的匯合度時進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 Oct-4和Survivin基因shRNA的設(shè)計與合成

根據(jù) GenBank 的 Survivin 基因序列(Accession No. NM001168) 和 Oct-4基因序列(Accession No. DQ486513.1) 設(shè)計相應(yīng)的shRNA。設(shè)計條件為：1) 排除含有連續(xù)4個G/C或A/T的序列；2) 排除兩端存在AA的序列；3) 排除定位在堿基易突變點的序列；4) 排除其他人類基因的同源性序列。Surv-shRNA序列為 5′-gaa agt gcg ccg tgc cat c-3′，位于全長Survivin編碼序列的第387~405 bp。Oct4-shRNA序列為5′-ccc tca ctt cac tgc act gta-3′，位于全長Oct-4編碼序列的第 1233~1253 bp。同時設(shè)計陰性對照 (CtrlshRNA) 序列5′-gac ttc ata agg cgc atg c-3′。由武漢市晶賽生物工程技術(shù)有限公司合成，合成的編碼shRNA的DNA結(jié)構(gòu)為：XhoⅠ+BamHⅠ+U6+ Sense DNA+Loop (ttc aag acg) +Antisense DNA+ TTTTTT+BglⅡ，克隆入pGenesil-1.1。

1.2.3 腺病毒載體的構(gòu)建與病毒包裝

將上述構(gòu)建的Survivin、Oct-4和陰性對照3個shRNA質(zhì)粒酶切回收，目的基因片段插入到腺病毒穿梭載體pDC312的多克隆位點，經(jīng)酶切鑒定正確后，分別命名為pDC312-Surv-shRNA、pDC312-Oct4-shRNA和pDC312-Ctrl-shRNA。同時將 Surv-shRNA (正向插入 SalⅠ+BglⅡ) 和 Oct4-shRNA (反向插入BamHⅠ+BglⅡ) 克隆入pDC312中，構(gòu)建含雙靶向 shRNA 的載體pDC312-Dual-shRNA。

用含有 10%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，對數(shù)生長期時用0.25%胰酶消化傳代，轉(zhuǎn)種于6孔培養(yǎng)板，置于37 ℃飽和濕度及5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)生長48 h，待細(xì)胞匯合度為60%時，同時轉(zhuǎn)染pBHGloxdeltaE13Cre和上述含 shRNA的腺病毒穿梭載體質(zhì)粒 pDC312-Dual-shRN、pDC312-Surv-shRNA、pDC312-Oct4-shRNA和 pDC312-Ctrl-shRNA，轉(zhuǎn)染方法參考Invitrogen公司 LipoFectamine2000試劑盒說明書。共轉(zhuǎn)染12 d后出現(xiàn)病毒空斑，經(jīng)過空斑純化，得到重組腺病毒，分別命名為Ad5-Dual-shRNA、Ad5-Surv-shRNA、Ad5-Oct4-shRNA和Ad5-CtrlshRNA。用病毒基因組提取試劑盒QIAGEN DNA Blood Mini Kit提取病毒基因組DNA，進(jìn)行PCR鑒定。鑒定正確后，采用 HEK293細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增及常規(guī)氯化銫梯度離心純化方法，擴(kuò)增及純化腺病毒。

1.2.4 shRNA 腺病毒載體對基因表達(dá)的沉默作用

取對數(shù)生長期的肝癌細(xì)胞系EHBH-H1鋪于6孔板，24 h后按 MOI=50分別感染腺病毒Ad5-Dual-shRNA、Ad5-Surv-shRNA、Ad5-Oct4-shRNA和 Ad5-Ctrl-shRNA，并設(shè)不加病毒的對照組，在37 ℃飽和濕度及5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后移去培養(yǎng)液，PBS洗3次后，加細(xì)胞裂解蛋白提取液，室溫下處理30 min，12 000 r/min離心收集上清，定量后分裝于 EP管-80 ℃保存。

Western blotting操作方法檢測培養(yǎng)細(xì)胞中Oct-4與Survivin蛋白的表達(dá)情況。將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，每孔上樣20 μL，電泳結(jié)束后用半干轉(zhuǎn)印儀將電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到NC膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加一抗 (1∶1 000稀釋)，室溫孵育3~4 h或4 ℃過夜，TBST洗膜5 min，重復(fù)5次，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗 (1∶10 000稀釋)，室溫孵育1 h，TBST洗膜5 min，重復(fù)5次后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，暗室曝光，膠片掃描后分析目標(biāo)條帶的分子量和光密度值。

1.2.5 MTT實驗

收集對數(shù)生長期的EHBH-H1細(xì)胞計數(shù)，用10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，按1×l04個細(xì)胞/孔鋪96孔板，每孔100 μL。置于37 ℃飽和濕度及5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。用無血清培養(yǎng)液稀釋病毒，按MOI = 0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50加入l00 μL稀釋好的病毒液分別感染腺病毒，對應(yīng)于每個MOI值設(shè)置4個復(fù)孔，置于37 ℃飽和濕度及5% CO2的培養(yǎng)箱中，7 d后棄去培養(yǎng)液，加入無血清的DMEM培養(yǎng)液100 μL/孔和5 g/L的MTT 1 0 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4~6 h，之后每孔加入100 μL 10% SDS培養(yǎng)過夜，用酶聯(lián)免疫檢測儀570 nm波長測定光吸收值，計算細(xì)胞存活率。

1.2.6 動物實驗

取對數(shù)生長期的EHBH-H1細(xì)胞懸液，計數(shù)后按5×106個細(xì)胞/100 μL注射于裸鼠前肢右側(cè)皮下，恒溫、通風(fēng)、無菌條件下飼養(yǎng)。注射約1周后，在接種區(qū)皮下出現(xiàn)米粒大小移植瘤。剔除瘤體過大和過小的裸鼠，剩余25只，隨機(jī)分為5組：Ad5-Dual-shRNA、Ad5-Surv-shRNA、Ad5-Oct4-shRNA、Ad5-Ctrl-shRNA、空白對照組，每組5只。每組釋以2×108PFU/100 μL的重組病毒瘤內(nèi)多點注射，隔日1次，共5次；空白對照組以生理鹽水替代重組病毒注射，100 μL×5次。開始治療后，定時測量瘤體大小，以“最大徑×最小徑2×0.5”公式計算瘤體體積。

觀察周期結(jié)束，斷頸處死小鼠，取瘤體標(biāo)本，以10%中性緩沖福爾馬林固定，石蠟包埋切片。采用 SP雙染色法免疫組化定位腫瘤組織中Survivin、Oct-4的表達(dá)。在5個高倍視野下計數(shù)每張切片中陽性細(xì)胞的比例。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 腺病毒介導(dǎo)特異性shRNA對基因表達(dá)的沉默作用

EHBH-H1細(xì)胞系按MOI=50感染特異性腺病毒載體48 h后，Ad5-Dual-shRNA組Oct-4與Survivin蛋白的表達(dá)均轉(zhuǎn)陰，Ad5-Surv-shRNA和Ad5-Oct4-shRNA能夠各自下調(diào)相應(yīng)的基因表達(dá)水平，但Ad5-Oct4-shRNA對Survivin蛋白的表達(dá)也有一定的下調(diào)作用 (圖1)。結(jié)果顯示雙靶向載體Ad5-Dual-shRNA能夠有效地沉默Oct-4與Survivin基因的表達(dá)。

2.2 雙靶向shRNA腺病毒對肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用

EHBH-H1細(xì)胞按不同的感染強度感染shRNA腺病毒，隨著病毒滴度的增加，細(xì)胞的存活率都有明顯的下降 (圖 2)。在 MOI=0.1和 1時，Ad5-Dual-shRNA組細(xì)胞的平均存活率已下降到 43.7%和 22.4%，顯著低于其他各組(P<0.01)。Ad5-Surv-shRNA 組與 Ad5-Oct4-shRNA 組的細(xì)胞存活率也低于空白對照和Ad5-Ctrl-shRNA組。結(jié)果說明特異性雙靶向載體Ad5-Dual-shRNA 能夠顯著地抑制肝癌細(xì)胞系EHBH-H1的增殖。

2.3 雙靶向shRNA腺病毒抑制肝癌裸鼠移植瘤的生長

EHBH-H1細(xì)胞裸鼠移植瘤經(jīng)病毒治療后，第10天Ad5-Dual-shRNA組瘤體體積已出現(xiàn)明顯差異 (圖 3)。至 20 d，Ad5-Dual-shRNA、Ad5-Surv-shRNA、Ad5-Oct4-shRNA、Ad5-CtrlshRNA、空白對照組腫瘤體積分別為 (250.87± 17.37)、(671.27±212.03)、(566.16±123.71)、(980.66±95.84)、(1 101.13±273.14) mm3。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，Ad5-Dual-shRNA、Ad5-Surv-shRNA、Ad5-Oct4-shRNA 組與對照組相比差異顯著(P＜0.01)，以 Ad5-Dual-shRNA組療效最好。Ad5-Ctrl-shRNA 組與對照組相比無顯著差異(P>0.05)。

圖1 Survivin和Oct-4特異性shRNA對目的基因表達(dá)的沉默作用Fig. 1 The silencing effect of specific shRNA on the expression of Survivin and Oct-4 proteins. 1: control group; 2: Ad5-Dual-shRNA group; 3: Ad5-Surv- shRNA group; 4: Ad5-Oct4-shRNA group; 5: Ad5-Ctrl-shRNA group.

圖2 MTT法檢測癌細(xì)胞存活率Fig. 2 Cell viability was assayed by MTT test.

圖3 肝癌裸鼠移植瘤shRNA病毒治療的療效對比Fig. 3 HCC xenograft models were established by subcutaneous injection of 5×106 EHBH-H1 cells per mouse in five groups of nude mice (n=5/group).

2.4 病理檢查

移植瘤治療后，取瘤體標(biāo)本，石蠟包埋切片，做 Oct-4和 Survivin表達(dá)的雙染免疫組化，Survivin標(biāo)記為深藍(lán)色 (NBT/BCIP顯色)，Oct-4標(biāo)記為紅色 (AEC顯色)。可以看出，空白對照組 Oct-4與 Survivin的表達(dá)呈雙陽性；Ad5-Surv-hRNA組Survivin陰性而Oct-4陽性，陽性反應(yīng)主要集中在細(xì)胞核和細(xì)胞漿；Ad5-Oct4-shRNA組Oct-4陰性，同時 Survivin陽性表達(dá)率下降；Ad5-DualhRNA組 Oct-4和 Survivin表達(dá)均明顯下降(圖4)。

圖4 肝癌裸鼠移植瘤免疫組化檢測Survivin (NBT/BCIP藍(lán)色標(biāo)記) 和Oct-4 (AEC紅色標(biāo)記) 的表達(dá)Fig. 4 The results of immunocytochemistry for Survivin (prussian blue stained with NBT/BCIP) and Oct-4 (red stained with AEC).

3 討論

Survivin基因已成為腫瘤藥物和基因治療的一個理想靶點，其抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的作用已有較多文獻(xiàn)報道，主要是通過抑制caspase級聯(lián)反應(yīng)下游的 caspase-3、caspase-7等發(fā)揮其抗凋亡作用[11]，而其體內(nèi)調(diào)節(jié)機(jī)制以及與其他關(guān)鍵基因之間的相互作用還存在諸多問題有待解決。有實驗證實，小鼠胚胎細(xì)胞 Survivin的功能活性受Oct-4轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)，降低細(xì)胞Oct-4表達(dá)會明顯抑制Survivin基因啟動子的活性，從而抑制Survivin的表達(dá)[12]。近來的研究也證實，人體很多類型的腫瘤細(xì)胞都有較高水平的Oct-4表達(dá)，可能參與維持腫瘤細(xì)胞特別是腫瘤干細(xì)胞的自我更新、阻止腫瘤細(xì)胞分化等功能[13]。那么，在惡性轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞中，Survivin和Oct-4之間是否存在相互調(diào)節(jié)或影響的關(guān)系，目前國內(nèi)外尚未見文獻(xiàn)報道。我們已有的研究發(fā)現(xiàn)，在肝膽腫瘤中轉(zhuǎn)錄因子Oct-4對Survivin的表達(dá)有正向調(diào)節(jié)作用，Oct-4是Survivin表達(dá)的上游調(diào)控基因。Oct-4引起的Survivin增強表達(dá)，直接促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞周期的進(jìn)展和細(xì)胞凋亡的抑制，而沉默Survivin表達(dá)則引起細(xì)胞周期阻滯，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。

RNA干擾 (RNA interference, RNAi) 是指在進(jìn)化過程中高度保守的、由雙鏈RNA誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。其作用機(jī)制是雙鏈RNA被特異的核酸酶降解，產(chǎn)生干擾小RNA (siRNA)，這些siRNA與同源的靶RNA互補結(jié)合，特異性酶降解靶 RNA，從而抑制、下調(diào)基因表達(dá)。由于使用RNAi技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達(dá)，所以該技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成為基因治療、基因結(jié)構(gòu)功能研究的快速而有效的方法[15]。針對腫瘤細(xì)胞Survivin高表達(dá)而設(shè)計的siRNA在腦膠質(zhì)瘤[16]、胰腺癌[17]、膀胱癌[18]的實驗中，均能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞的生長，產(chǎn)生抗癌作用。結(jié)果顯示RNAi技術(shù)用于腫瘤的基因治療具有可靠的療效和良好的發(fā)展前景。

根據(jù)上述Oct-4增強Survivin表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制，本項研究構(gòu)建 Oct-4和 Survivin雙特異性shRNA的腺病毒表達(dá)載體，研究其對肝癌細(xì)胞EHBH-H1的抑制作用。體外細(xì)胞學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，雙靶向 shRNA載體能夠同時有效地沉默 Oct-4與 Survivin基因的表達(dá)，從而抑制肝癌細(xì)胞系EHBH-H1的增殖活性，其效果與病毒感染強度密切相關(guān)。雙靶向shRNA載體對肝癌細(xì)胞生長的抑制作用，明顯強于單一靶向的shRNA載體。研究中發(fā)現(xiàn)，Oct4-shRNA可引起Survivin表達(dá)抑制，這與我們先前的實驗相一致，證實 Oct-4是Survivin的上游調(diào)控因子[14]。在EHBH-H1裸鼠移植瘤的實驗中，我們進(jìn)一步證實了針對Oct-4和Survivin的雙特異性shRNA載體能夠沉默Oct-4與Survivin的表達(dá)，明顯抑制移植瘤的生長。而單一抑制Survivin的表達(dá)，對移植瘤的抑制效果和維持時間均十分有限，停止治療后移植瘤出現(xiàn)恢復(fù)性生長的現(xiàn)象。單一抑制Oct-4的表達(dá)，療效好于Survivin特異性shRNA載體。

綜上所述，我們構(gòu)建的針對Oct-4和Survivin的雙靶向特異性腺病毒載體，不僅能夠有效抑制目的基因的表達(dá)，而且能在體內(nèi)、體外抑制肝癌細(xì)胞的增殖活性和裸鼠移植瘤的生長，發(fā)揮出良好的抗腫瘤效果。實驗證明，雙靶向 shRNA表達(dá)載體在腫瘤基因治療中具有更好的優(yōu)勢。而且，在抑制癌細(xì)胞Survivin表達(dá)控制細(xì)胞生長的同時，敲除Oct-4的表達(dá)有可能進(jìn)一步抑制具有腫瘤干細(xì)胞特性的細(xì)胞的增殖。

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