門燕，朱玥明，管于平，張同存，何森健，孫媛霞

1 天津科技大學生物工程學院，天津 300457

2 中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所，天津 300308

遠在公元前 16世紀，中國就會利用微生物釀酒，微生物發(fā)酵方法至今仍應用于食品加工中，如醋、醬油、酸奶等制造業(yè)。該類微生物 被 稱 為 食 品 級 微 生 物 (Food-grade microorganisms)，屬于一般公認安全 (Generally recognized as safe，GRAS) 微生物范疇。這類食品級微生物主要有：真菌中的曲霉菌和酵母菌，細菌中的乳酸菌和枯草芽胞桿菌等[1]，這些微生物在食品工業(yè)中得到了越來越廣泛的應用。

D-塔格糖 (D-果糖同分異構體) 是目前被發(fā)現(xiàn)的一種新型的低熱量的功能性甜味劑[2]。D-塔格糖的味道和口感與蔗糖相似，但是 D-塔格糖的熱量值僅有7.3 kJ/g，只占蔗糖能量的30%[3]。對于血糖醫(yī)學指數(shù)的研究表明，D-塔格糖不會引起血液中葡萄糖水平的增加，因此D-塔格糖的使用對于糖尿病患者是安全的[4-5]；不同于蔗糖，它不會促進蛀牙生長，并具有抑制齲齒、牙齦炎、消除口臭及潔齒等作用[6-7]。2001年美國食品與藥物管理局 (FDA) 確定 D-塔格糖為普遍公認安全食品 (GRAS)[8]。

L-阿拉伯糖異構酶 (L-arabinose isomerase，L-AI) 是一種能夠催化 L-阿拉伯糖轉化為 L-核酮糖的異構化酶，由于D-半乳糖和L-阿拉伯糖在結構上具有一定的相似性，其在C3、C4的位置上均有一個 L-型順式羥基結構，因此在體外L-AI能使D-半乳糖轉化為D-塔格糖[3,9-11]。由此可見L-AI是實現(xiàn)生物法生產D-塔格糖的重要生物催化劑[12]。

研究發(fā)現(xiàn)，L-AI對D-塔格糖的轉化率隨反應溫度的升高而增加，因此以往篩選得到的多來源于嗜熱菌，例如嗜熱桿菌Thermoanaerobacter mathrani[13]，嗜熱脂肪芽胞桿菌 Bacillus stearothermophilus US100[14]等。但這些嗜熱菌及其來源基因的食品安全性受到質疑，研究學者開始篩選食品級微生物開展轉化生產D-塔格糖的研究，Cheetham等[15]利用蓋氏乳桿菌Lactobacillus gayonii代謝產生 L-阿拉伯糖異構酶成功轉化半乳糖生成塔格糖，第一次提出利用乳酸菌生產塔格糖的設想。Chouayekh，Zhang H等[16-17]利用來自于植物乳桿菌 Lactobacillus plantarum 的L-AI的基因克隆表達進行半乳糖的轉化成為塔格糖。Rhimi等[18]在食品級基礎上克隆表達了來自于米酒乳桿菌Lactobacillus sakei 23K的耐酸L-AI基因，利用酶法轉化生成了塔格糖。還有2011 年來源于發(fā)酵乳桿菌 Lactobacillus fermentum[19]等食品級菌株L-AI的應用的報道。

本研究通過食品級菌種的篩選，從各種酸奶泡菜制品中篩選出一株產 L-AI的菌株，將其L-AI基因克隆，構建質粒，并成功表達了具有生物活性的重組L-AI，利用微生物酶法轉化生成塔格糖，為更進一步通過定點突變和基因重組的手段研究生物轉化法制備 D-塔格糖提供新材料，開拓新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集與培養(yǎng)基

從各種酸奶制品、泡菜以及其他一些食品中采集不同的樣品，將上述樣品培養(yǎng)在MRS固體培養(yǎng)基平板上，涂布、劃線分離。

1) 改良肉湯培養(yǎng)基 (MRS)[20]：蛋白胨l0.0 g；牛肉膏10.0 g；酵母粉5.0 g；乙酸鈉5.0 g；檸檬酸三銨 2.0 g；磷酸氫二銨 2.0 g；MgSO4·7H2O：0.58 g；MnSO4·H2O∶0.25 g；吐溫-80 1 mL；蒸餾水1000 mL；葡萄糖2%，為避免葡萄糖高溫滅菌時發(fā)生一定程度的焦化，配制培養(yǎng)基時，單獨將其配置成20%的糖溶液。待培養(yǎng)基完全溶解，調pH至6.2~6.6。

2) 平板及斜面培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基中添加20 g/L瓊脂。

1.1.2 菌種與質粒

作為質?？寺〉乃拗骶竽c桿菌Escherichia coli DH5α、目的基因表達的宿主菌E. coli BL21為本實驗室保存；克隆以及表達載體pET-21a (+)購自Novagen公司。

1.1.3 生化試劑

PCR引物由華大基因合成 (表1)；細菌基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、普通質粒小提試劑盒購自天根生化科技有限公司；T4 DNA連接酶、BamHⅠ、Hind Ⅲ限制性內切酶購自于寶生物工程有限公司。

表1 16S rDNA通用引物序列和PCR擴增L-AI的引物序列Table 1 The general primers of 16S rDNA and PCR amplification primers of L-AI gene

1.2 方法

1.2.1 菌種初篩

將篩得的菌株，分別接種到裝有100 mL的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h，將發(fā)酵液等量分裝于 2個離心管中，其中一管離心20 min (4 ℃，12 000 r/min) 獲得菌體，懸浮于2 mL ddH2O中，超聲破碎5 min后，離心去除細胞碎片，取上清液 (即為粗酶液) 進行酶反應。酶促反應條件為：取500 μL粗酶液與500 μL 1%D-半乳糖，35 ℃反應過夜。

另一管未做細胞破碎的菌體離心棄上清后直接進行酶反應。酶反應條件為：加入500 μL 1%D-半乳糖液以及500 μL ddH2O，35 ℃反應過夜。同時進行對照實驗。

酶反應結束后，加熱至95 ℃、5 min終止反應，采用半胱氨酸-咔唑法[21]進行顯色反應。

1.2.2 乳酸菌的生理生化鑒定

將篩得的菌株根據參考文獻[22]所列乳酸菌種鑒定方法進行鑒定。

1.2.3 16S rDNA克隆及系統(tǒng)進化樹的建立

以基因組DNA為模板，利用16S rDNA基因的通用引物 (Lac-F、Lac-R)，進行PCR擴增。將擴增獲得的PCR產物進行序。

PCR 擴增條件為：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.2.4 Pediococcus pentosaceus PC-5 L-AI基因序列擴增

根 據 NCBI 基 因 庫 中 Pediococcus pentosaceus ATCC 25745 (GenBank Accession No. CP000422.1) 菌中的L-AI基因序列設計引物(PPAI-F、PPAI-R)，上下游引物 5'端分別引入BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切位點。

PCR擴增條件為：94 ℃預變性10 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.2.5 Pediococcus pentosaceus PC-5 L-AI基因表達質粒的構建

純化后的L-AI的PCR基因片段和表達載體pET-21a (+) 用限制性內切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ分別進行雙酶切反應。回收后的目的片段與載體用T4 DNA連接酶在4 ℃連接過夜，連接產物轉化至E. coli DH5α感受態(tài)中進行克隆，PCR篩選陽性克隆，雙酶切鑒定，挑取陽性轉化子轉入E. coli BL21進行誘導表達，并將重組質粒送華大基因測序。

1.2.6 重組L-AI的誘導表達

挑取陽性菌落E. coli BL21 (pET-PPLAI)接入 3 mL LB-Amp培養(yǎng)基 (Amp終濃度為100 mg/L) 中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)過夜，將上一步活化的菌接種至 100 mL LB-Amp培養(yǎng)基(Amp終濃度為100 mg/L) 中，37 ℃培養(yǎng)3~4 h至OD600約0.6~0.8，即細菌生長對數(shù)期，加入IPTG (終濃度0.5 mmol/ L) 誘導表達，分別以37 ℃、200 r/min培養(yǎng)3 h，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)6 h，20 ℃、100 r/min培養(yǎng)過夜。

收集誘導后的菌體，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄去上清，并用ddH2O洗滌菌體2次，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄去上清，用2 mL ddH2O懸浮，并在冰上超聲破碎細胞，離心20 min，取上清液50 μL，加入50 μL 2×SDS上樣緩沖液，用于SDS-PAGE檢測。同時將只含有pET-21a (+) 的E. coli BL21進行以上實驗操作作為對照。

1.2.7 重組L-AI粗酶的酶活檢測

L-AI的活性通過D-塔格糖生成的含量來測定。在標準條件下，反應體系包括：1%D-半乳糖，0.5 mmol/L CoCl2，1 mmol/L MnCl2，300 μL粗酶，用 ddH2O補足至 1 mL (對照反應不加MnCl2測酶活力)。酶促反應在30 ℃、40 ℃恒溫下過夜，在100 ℃水浴中處理5 min滅活酶的活性停止反應。生成的D-塔格糖的含量采用HPLC高效液相色譜法。安捷倫高效液相色譜儀1200，分析柱：Waters Sugar Pak1，流動相：去離子水，柱溫80 ℃，流速0.5 mL/min，進樣量20 μL，檢測器：示差檢測器。

2 結果與分析

2.1 菌種初篩結果

采用半胱氨酸-咔唑法，對篩出的20株菌株進行顯色反應。對于菌體超聲破碎獲得的上清液進行的酶反應，通過顏色比較，顯色結果并不理想，但在分光光度計測出在560 nm下有一株菌顯示較小的吸光值，顯示出弱的L-AI活性，將其初步確定為具有產塔格糖能力的菌株，命名為PC-5菌株；對于所有用全細胞進行的酶促反應來說，均沒有檢測到酶活。

2.2 菌株的細胞形態(tài)及生理生化鑒定

菌株在液體MRS培養(yǎng)基中37 ℃靜置培養(yǎng)12 h，細菌生長狀況良好，菌體呈白色，并沉降在培養(yǎng)基的底部。菌體在固體 MRS培養(yǎng)基中37 ℃倒置培養(yǎng)48 h，菌落圓形，白色扁平，邊緣圓整。由革蘭氏染色結果可知，該PC-5菌株為革蘭氏陽性菌，細胞形狀呈球形，呈片狀排列，直徑0.8~1.0 μm。同時，在表2中也比較了PC-5菌株與相關菌株的生理生化特性，其結果顯示PC-5菌株與P. pentosaceus[22]的相關生理生化特征較為相似，接觸酶均為陰性；不能水解淀粉；明膠液化實驗結果均為陰性；均可利用葡萄糖、麥芽糖、乳糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖、柳醇作為碳源。據此鑒定PC-5菌株屬于片球菌屬。

2.3 菌株16S rDNA基因測序及系統(tǒng)進化樹

通過分析測定獲得該片段序列，利用BLAST軟件將該序列與美國國家生物信息中心(NCBI) 收錄的DNA序列進行比對，基于相關菌株16S rDNA序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹 (圖1)。結果表明，PC-5菌株16S rDNA序列與Pediococcus pentosaceus屬的相似性最高。根據16S rDNA序列分析結果，結合其形態(tài)和生理生化特性，該菌被鑒定為Pediococcus pentosaceus，并將該菌株命名為Pediococcus pentosaceus PC-5。

2.4 PC-5菌L-AI基因的擴增

從 NCBI上查得 Pediococcus pentosaceus ATCC 25745 (GenBank Accession No. CP000422.1) 此菌株含有表達L-AI的基因序列，根據該序列設計引物，則以PC-5菌基因組為模板，PCR擴增L-AI基因。從PC-5菌中擴增出大小約為1 400 bp的DNA片段，與L-AI基因的已知大小相符。

表2 PC-5菌株及相關菌株的特征比較Table 2 Comparison of the phenotypic characteristics of strain PC-5 and the related strains

2.5 L-AI基因表達質粒的構建與驗證

重組質粒經 BamHⅠ和 Hind Ⅲ雙酶切驗證與菌落 PCR驗證，結果均獲得目的基因片段1 400 bp左右 (圖2、3)，表明含L-AI基因的原核表達質粒構建成功。測序結果顯示，Pediococcus pentosaceus PC-5菌株的L-AI序列結果顯示目的基因片段的大小為1 426 bp，與預期結果一致。將該基因序列提交至GenBank，獲取登錄號為：JN377428。

2.6 重組L-AI基因的誘導表達結果

將重組質粒pET-PPLAI轉入表達載體E. coli BL21，選取陽性菌落加入IPTG進行誘導表達，同時，利用相同條件培養(yǎng)含有 pET-21a (+) 的E. oli BL21作為對照。

實驗結果表明，E. coli BL21 (pET-PPLAI)培養(yǎng)液在加入IPTG后，20 ℃、100 r/min過夜培養(yǎng)為最佳誘導表達條件，由 SDS-PAGE可知(圖4)，重組蛋白粗提物在58 kDa 附近有一明顯的特異性條帶，對照菌的蛋白粗提物在該位置無明顯條帶。在此條件下重組蛋白以可溶性形式存在，幾乎沒有包涵體的生成。利用DNAMAN軟件計算出實際PPLAI理論值為54 kDa，與預期結果幾乎為一致。

2.7 重組L-AI粗酶的酶活

將重組L-AI進行酶促反應后，由HPLC檢測反應結果，在1% D-半乳糖，300 μL粗酶提取物的反應體系下，未加Mn2+的反應體系結果在 16.49 min沒有峰出現(xiàn) (D-塔格糖的保留時間)，該結果與以往多數(shù)文獻報道中指出“在沒有金屬離子存在的情況下，L-AI一般是沒有或者極低地顯示出異構化 D-半乳糖的活性[23]”，“L-AI多數(shù)依賴Co2+、Mn2+作為輔因子增強其酶活力及熱穩(wěn)定性[14]”的結果一致，金屬離子Mn2+的攝入對于重組L-AI的酶促反應的進行是必需的。由色譜圖分析可見 (圖 5)，從Pediococcus pentosaceus PC-5獲得的L-AI具有催化D-半乳糖轉化為D-塔格糖的能力，且轉化率隨反應溫度的增加而提高，30 ℃、40 ℃反應過夜 12 h，底物 1%D-半乳糖轉化率分別約為30%和33%。

圖1 PC-5菌株與其他細菌的系統(tǒng)進化樹Fig. 1 Phylogennetic relationships of 16S rDNA gene of PC-5 and related species.

圖2 重組pET-PPLAI的酶切驗證Fig. 2 Identification of positive plasmid of pET-PPLAI by enzyme digestion. M: DNA marker; 1: L-AI; 2: pETPPLAI; 3: pET-21a (+).

圖3 重組pET-PPLAI的PCR驗證Fig. 3 Identification of positive plasmid of pET-PPLAI by PCR. M: DNA marker; 1: PCR product of pET-PPLAI; 2: PCR product of pET-21a (+).

圖4 重組質粒pET-PPLAI在E. coli BL21中的表達Fig. 4 SDS-PAGE analysis of recombinant proteins expressed in E. coli BL21. M: protein markers; 1: total cell (pET-21a (+) without IPTG); 2: total cell (pET-21a (+) with IPTG); 3: supernatant (pET-21a (+)); 4: precipitation (pET-21a (+)); 5: total cell (pET-PPLAI without IPTG); 6: total cell (pET-PPLAI with IPTG); 7: supernatant (pET-PPLAI); 8: precipitation (pET- PPLAI).

圖5 HPLC分析D-塔格糖的產量Fig. 5 HPLC analysis of the D-tagatose production. (A) Standard solution of D-galactose and D-tagatose at 10 g/L. (B) Isomerization products after 12 h of reaction at 30 °C. (C) Isomerization products after 12 h of reaction at 40 °C. 1: D-Galactose with a retention time of 13.81 min; 2: D-tagatose with a retention time of 16.49 min.

3 結論

本研究采用了半胱氨酸咔唑法初步篩選出具有轉化生產塔格糖能力的食品級菌株，確定為戊糖片球菌，并將其L-AI基因在E. coli BL21異源表達。經 IPTG 誘導表達后, 約在58 kDa處明顯出現(xiàn)目的蛋白條帶，與預期結果幾乎相符，由SDS-PAGE電泳結果可知，在此條件下重組蛋白以可溶性形式存在，幾乎沒有包涵體的生成。在溫度40 ℃，1%底物、300 μL粗酶的條件下反應過夜，以半乳糖為底物轉化為塔格糖，轉化率可以達到33%。目前，利用食品級菌株微生物酶法將半乳糖轉化為塔格糖，在食品工業(yè)上廣泛應用。對此，我們將由戊糖片球菌獲得的重組酶的純化以及提高塔格糖的產率作為下一步工作的重點方向。

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