彭曉靜，季俊杰，張玉秀，楊克遷，張紅梅，朱卉

1 中國礦業(yè)大學(xué) (北京) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，北京 100083

2 中國科學(xué)院微生物研究所 微生物資源前期開發(fā)國家重點實驗室，北京 100101

雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng) (Two component system，TCS) 是生物中非常保守的調(diào)控系統(tǒng)，橫貫三域生物，通常由組氨酸激酶 (Histidine kinase，HK) 和應(yīng)答調(diào)控蛋白 (Response regulator，RR) 兩個組分構(gòu)成。在細(xì)菌中，已報道的基因組上幾乎都發(fā)現(xiàn)了 TCS的編碼基因，且其編碼基因數(shù)量更是占據(jù)細(xì)菌基因總數(shù)的1%之多[1]。TCS涉及細(xì)菌調(diào)控的許多方面，如代謝調(diào)控、磷酸吸收、厭氧/好氧生長以及復(fù)雜的發(fā)育應(yīng)答等，被認(rèn)為是整個原核生物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中最具代表性的調(diào)控模式。在典型的 TCS中，編碼HK和RR的基因在基因組中毗鄰[1-3]，HK一般定位在細(xì)胞膜上，而RR是胞內(nèi)蛋白。外界信號首先通過結(jié)合 HK膜外信號感受結(jié)構(gòu)域(Sensor domain) 改變HK的構(gòu)象使其自磷酸化。磷酸化的HK將高能磷酸基團(tuán)傳遞給RR，使RR磷酸化。而磷酸化使絕大多數(shù)RR從無活性的單體轉(zhuǎn)變成有活性的二聚體，并借助其輸出結(jié)構(gòu)域(Output domain，指DNA-binding domain) 控制目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控一系列的細(xì)胞行為[4]。在這個“短小精干”的系統(tǒng)中，RR是最終的執(zhí)行者，作為磷酸化控制的開關(guān)，連接外界環(huán)境信號刺激和細(xì)胞內(nèi)的活動。

典型的 RR由保守的 N端 REC結(jié)構(gòu)域(Receiver domain) 以及C端多變的具有DNA結(jié)合能力的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域 (Effector domain) 構(gòu)成。RR的REC結(jié)構(gòu)域是一個β折疊片包圍5個α螺旋的α/β結(jié)構(gòu)，β折疊片有5個保守的氨基酸與該區(qū)域的磷酸化功能有關(guān)，包括磷酸化位點Asp57，結(jié)合Mg2+的Asp12和Asp13，與磷酸基團(tuán)相互作用的 Lys109以及一個在激活機(jī)制中起直接作用的Thr87 (以典型RR CheY為例)。典型RR中，REC具有由磷酸化控制的非活性和活性兩種特定的構(gòu)象狀態(tài)，非活性狀態(tài)是單體 (個別為二聚體) 構(gòu)象，當(dāng)REC結(jié)構(gòu)域中的保守關(guān)鍵氨基酸Asp57接受來自HK的磷酸基團(tuán)，RR的構(gòu)象發(fā)生變化，REC結(jié)構(gòu)域之間利用α4-β5-α5界面的相互作用形成有活性的同源二聚體，通過構(gòu)象變化調(diào)控效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的DNA結(jié)合活性，引發(fā)適應(yīng)外界環(huán)境改變的基因表達(dá)，從而執(zhí)行一系列的下游功能[5]。RR的磷酸化最終決定該系統(tǒng)的信號輸出，因此磷酸化是典型RR的特征。

隨著相關(guān)基因組序列的公布，以及調(diào)控蛋白功能的深入研究，人們逐漸發(fā)現(xiàn)和認(rèn)識了一類特殊的RR。這類RR并不含有整套保守的參與磷酸化功能的氨基酸，并且在基因組中不與HK毗鄰。2004年，Hutchings等將這類蛋白命名為非典型應(yīng)答調(diào)控蛋白 (Atypical response regulator，ARR)[6-7]。雖然 ARR的序列和三維結(jié)構(gòu)與典型RR極其相似，但是到目前為止尚無一例ARR被證明可以接受磷酸基團(tuán)，其功能調(diào)控機(jī)理未知。這就暗示 ARR可能存在替代磷酸化的調(diào)控機(jī)制。本研究組和譚華榮研究組合作，在國際上率先報道了 ARR結(jié)合小分子的調(diào)控機(jī)理，證明ARR調(diào)控代謝途徑的終產(chǎn)物可以反饋調(diào)控ARR的活性[8]。以下簡要概述已經(jīng)報道的 ARR的結(jié)構(gòu)、作用機(jī)理方面的研究進(jìn)展，并以目前唯一闡明調(diào)控機(jī)理的 ARR，杰多霉素生物合成途徑中的JadR1為例，剖析ARR在細(xì)菌調(diào)控過程中的作用機(jī)制。

1 非典型應(yīng)答調(diào)控蛋白 (ARR)

與典型RR相似，ARR也遍布三域生物。在細(xì)菌中，其往往與細(xì)胞的生長發(fā)育、次生代謝產(chǎn)物合成調(diào)控以及病原菌的毒力反應(yīng)緊密相關(guān)。典型 RR中磷酸化區(qū)域是控制其功能的關(guān)鍵要素[1-3]。RR REC結(jié)構(gòu)域上5個關(guān)鍵氨基酸構(gòu)成了接受磷酸基團(tuán)的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，如果這5個保守氨基酸中的2個被改變，RR接受磷酸基團(tuán)的能力就會喪失。ARR的三維結(jié)構(gòu)雖然和典型RR非常相似，但其REC結(jié)構(gòu)域中缺少5個保守氨基酸中的2個或多個，而且ARR編碼基因附近往往找不到相應(yīng)的HK編碼基因。由于ARR本身并不具備磷酸化的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，推測ARR可能借助一套與磷酸化無關(guān)的調(diào)控機(jī)制調(diào)節(jié)自身活性，發(fā)揮其調(diào)控作用[9-10]。目前，在結(jié)構(gòu)、聚集狀態(tài)及其與活性的關(guān)系方面研究的比較清楚的 ARR主要有HP1043、FrzS、NblR等[11-13]，但對其可能的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。

1.1 HP1043

HP1043 (HP-RR) 是 幽 門 螺 桿 菌Helicobacter pylori中hp1043編碼的一個細(xì)胞生長必需的調(diào)控蛋白，調(diào)控自身和 tlpB基因的轉(zhuǎn)錄[12,14-15]。HP-RR周圍未發(fā)現(xiàn)HK，是一個孤兒RR。與典型RR中OmpR/PhoB家族序列比對顯示，HP-RR缺失磷酸轉(zhuǎn)移所需的、位于酸性口袋的保守序列和磷酸化位點。HP-RR與啟動子序列的結(jié)合不依賴于磷酸化[10]。

NMR和X-ray數(shù)據(jù)表明，HP-RR是對稱的二聚體，分子拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)類似于典型 RR OmpR/PhoB家族的二聚體構(gòu)象。兩個HP-RR單體的REC結(jié)構(gòu)域利用α4-β5-α5界面形成緊密的二聚體，效應(yīng)結(jié)構(gòu)域通過一個復(fù)雜的連接子與REC結(jié)構(gòu)域相連接。二聚體中REC結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)類似于磷酸化后活化的 ArcA、PhoB的REC結(jié)構(gòu)域，且定點突變表明 HP-RR的單體也有活性[15]。因此該二聚體構(gòu)象就是 HP-RR在體內(nèi)的活性構(gòu)象。HP-RR的活化不依賴于磷酸化，不需要保守的磷酸化位點，是一個ARR。最近研究表明，HP-RR的表達(dá)同時受轉(zhuǎn)錄后和翻譯后修飾水平的調(diào)控，但是具體調(diào)控的機(jī)理還不清楚[15]。

1.2 FrzS

frzS位于操縱子frzA-F的上游，其編碼的蛋白 FrzS是細(xì)胞群集移動系統(tǒng)中的一個新元件，調(diào)控應(yīng)答調(diào)控蛋白RomR的定位[16]。FrzS在細(xì)胞極與極之間轉(zhuǎn)移，在決定細(xì)胞群集移動方向的一極累積[17-18]。FrzS的REC結(jié)構(gòu)域缺失典型RR中傳遞磷酸化信號和接受磷酸基團(tuán)的保守氨基酸。NMR實驗表明，其不結(jié)合Mg2+和磷酸基團(tuán)類似物Mg2+.BeF3。由此推測FrzS是一個ARR。

在晶體中FrzS通過α4-β5-α5界面相互作用形成四聚體和六聚體。定點突變結(jié)果表明，F(xiàn)rzS的REC結(jié)構(gòu)域行使功能依賴α4-β5-α5界面的識別作用而非磷酸化，這進(jìn)一步證明了 FrzS是一個 ARR。推測在應(yīng)答調(diào)控過程中，F(xiàn)rzS利用α4-β5-α5界面改變蛋白構(gòu)象，從而應(yīng)答響應(yīng)外界信號[11]。

1.3 NblR

NblR是藍(lán)細(xì)菌細(xì)長聚球藻 Synechococcus elongatus PCC 7942在強(qiáng)光脅迫時藻膽蛋白的降解及營養(yǎng)缺乏時應(yīng)答響應(yīng)過程中一個必需的蛋白，但其調(diào)控的目標(biāo)基因不詳。在NblR的REC結(jié)構(gòu)域中，Ser和 Met分別取代典型 RR中的Asp13和Thr87。雖然NblR有典型RR保守的磷酸化位點Asp57，但在體外實驗中沒有發(fā)現(xiàn)NblR被乙酰磷酸磷酸化。而且，NblR的Asp57突變株D57A的轉(zhuǎn)錄水平與野生型的相當(dāng)，表型、抵抗外界環(huán)境脅迫的能力無明顯差異[13]。因此，NblR是一個ARR。

NblR的三維結(jié)構(gòu)與FrzS和HP1043的晶體結(jié)構(gòu)相似，具有OmpR/PhoB家族保守的參與信號傳遞的α4-β5-α5界面。凝膠過濾色譜分析和酵母雙雜交實驗表明，無論在體外還是體內(nèi)，NblR都為單體狀態(tài)。因此 NblR可能與 OmpR/PhoB家族成員一樣利用 α4-β5-α5界面形成有活性的二聚體[13]，但其可能采用磷酸化以外的方式控制其活性二聚體和無活性的單體狀態(tài)的轉(zhuǎn)換。對NblR具體的構(gòu)象以及構(gòu)象與調(diào)控活性之間的關(guān)系還需要進(jìn)一步深入的研究。

1.4 AmiR

AmiR是一個結(jié)合RNA的轉(zhuǎn)錄激活調(diào)控蛋白。AmiR和AmiC組成受酰胺調(diào)控的轉(zhuǎn)錄反終止系統(tǒng)[19-21]，共同調(diào)控銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa PAC1的脂肪酰胺酶的誘導(dǎo)表達(dá)。AmiR是第一個有結(jié)合RNA晶體結(jié)構(gòu)報道的RR。AmiR的N端與典型RR的REC結(jié)構(gòu)域有很高的相似性，但是缺失典型RR中保守的5個氨基酸。而且AmiR的活性受AmiC的構(gòu)象變化調(diào)節(jié)而非磷酸化調(diào)節(jié)[22]。在沒有小分子誘導(dǎo)物時，2個AmiR利用連接其N端和C端結(jié)構(gòu)域的a螺旋間的coiled-coil相互作用形成二聚體，2個AmiC分子結(jié)合在AmiR二聚體的2個N端REC結(jié)構(gòu)域構(gòu)成“top surface”，形成不對稱的復(fù)合物AmiC-AmiR。該復(fù)合物中，AmiR活性被抑制，不能結(jié)合 RNA，使得脂肪酰胺酶操縱子上游的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、100 bp左右的mRNA可以形成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致酰胺酶操縱子的組成型轉(zhuǎn)錄在啟動子的下游提前終止。當(dāng)酰胺誘導(dǎo)物存在時，AmiC結(jié)合小分子誘導(dǎo)物，改變自身構(gòu)象，釋放復(fù)合物中的AmiR。AmiR形成識別特異序列的多聚體，C端結(jié)構(gòu)域結(jié)合新合成的mRNA，阻止其形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，從而防止轉(zhuǎn)錄提前結(jié)束[22]。因此，AmiR是一個ARR。但是，AmiR多聚體的化學(xué)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)以及與特定RNA序列相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)還有待進(jìn)一步研究。

通過對HP1043、FrzS、NblR等ARR的研究，現(xiàn)在對ARR的結(jié)構(gòu)、聚集狀態(tài)及其與活性的關(guān)系有一定的了解，但是具體的調(diào)控機(jī)制還不清楚。體外實驗表明這些ARR不能被磷酸化，但是目前仍未見其機(jī)制研究的報道。ARR在鏈霉菌中也廣泛存在，NCBI已發(fā)布至少13個鏈霉菌屬次級代謝合成基因簇編碼 ARR的基因。JadR1是目前鏈霉菌中調(diào)控功能和機(jī)制研究的比較清楚的 ARR，其功能分析將有助于我們理解ARR活性調(diào)控機(jī)理及其作用機(jī)制。

2 JadR1

杰多霉素是委內(nèi)瑞拉鏈霉菌 Streptomyces venezuelae ISP5230產(chǎn)生的一類角蒽環(huán)芳香聚酮次級代謝產(chǎn)物。杰多霉素的合成需要營養(yǎng)壓力和乙醇、熱激或噬菌體感染等環(huán)境壓力的刺激，是鏈霉菌屬中唯一一例被報道在環(huán)境壓力脅迫下產(chǎn)生的抗生素[23]，暗示其合成受到復(fù)雜的調(diào)控。序列分析表明，杰多霉素合成基因簇包含jadR2、R1、R*、W1、W2和W3 6個直接或間接參與杰多霉素生物合成基因表達(dá)調(diào)控的基因，其中JadR1是杰多霉素生物合成必不可少的調(diào)控子[24]。

jadR1位于杰多霉素合成基因簇中的第一個結(jié)構(gòu)基因jadJ的上游，與jadJ轉(zhuǎn)錄方向相同。其全長702 bp，編碼一個含233個氨基酸的蛋白，氨基酸序列比對表明其屬于最大的 RR家族——OmpR家族，其C端含有結(jié)合DNA的winged HTH (Helix-turn-helix) 結(jié)構(gòu)域，N端包含RR的特征結(jié)構(gòu)域，REC結(jié)構(gòu)域。序列比對表明，JadR1雖然具有推測的磷酸化位點Asp57，但是結(jié)合Mg2+的兩個Asp分別被Glu和Ser取代。以O(shè)mpR為陽性對照，進(jìn)行體外磷酸化實驗，相同條件下JadR1不可以被25 mmol/L的氨基磷酸酯磷酸化。因此，JadR1應(yīng)該是一個ARR。

JadR1是杰多霉素合成結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控子[25]，它能激活 jadJ等基因的轉(zhuǎn)錄，同時也能抑制自身轉(zhuǎn)錄。jadR1受位于其上游的jadR2產(chǎn)物調(diào)控。jadR2編碼的蛋白JadR2抑制杰多霉素的合成。委內(nèi)瑞拉鏈霉菌的jadR2失活突變株可以在無乙醇刺激的條件下合成杰多霉素。凝膠阻滯 (Electrophoretic mobility shift assay，EMSA)實驗證明，JadR2可以特異性地結(jié)合于jadR1的啟動子區(qū)域。JadR2可能通過阻礙RNA聚合酶結(jié)合于jadR1的啟動子區(qū)域，阻止jadR1的轉(zhuǎn)錄，從而間接抑制杰多霉素的合成。杰多霉素 B (Jadomycin B，JdB) 或A (Jadomycin A，JdA) 可以與JadR2結(jié)合，使其從jadR1啟動子區(qū)釋放，從而解除對jadR1轉(zhuǎn)錄的抑制[26]。

圖1 杰多霉素合成基因簇Fig.1 Organizational map of jadomycin gene cluster.

圖2 JadR1的結(jié)構(gòu)域和保守氨基酸殘基位置示意圖Fig.2 The domain organization of JadR1. The amino acids corresponding to the conserved residues of typical RRs are marked.

EMSA 實驗和表面等離子共振 (Surface plasmon resonance，SPR) 實驗表明JadR1可以結(jié)合jadR1和jadJ的啟動子區(qū)域 (PjadR1和PjadJ)。因此，JadR1通過與jadJ及其自身啟動子區(qū)域的特異性結(jié)合來調(diào)控杰多霉素的合成。在前期工作中，王琳淇等通過 S1 mapping和 DNase I footprinting實驗進(jìn)一步確定了 JadR1結(jié)合于jadR1的上游非編碼區(qū)?4到?112區(qū)域。JadR1在低濃度時結(jié)合于jadR1中結(jié)合位點較上游的區(qū)域，在高濃度時與整個啟動子區(qū)域結(jié)合，阻止啟動子區(qū)域結(jié)合 RNA聚合酶，從而實現(xiàn)對自身的負(fù)調(diào)控。JadR1結(jié)合于 jadJ的上游非編碼區(qū)?27到?137，與其同源蛋白Aur1P相似，暗示JadR1很可能通過招募sigma因子對jadJ行使激活功能[8]。

王琳淇等實驗證明JdB影響JadR1與PjadR1和PjadJ的結(jié)合，低濃度的JdB可以使JadR1在jadJ啟動子區(qū)域上的結(jié)合更緊密；隨著JdB濃度的增大，JadR1從jadJ啟動子區(qū)域完全脫離。這說明低濃度JdB增強(qiáng)了JadR1對jadJ的激活，而高濃度JdB使JadR1喪失了對jadJ的激活功能。而對于jadR1啟動子，低濃度JdB加入反應(yīng)體系以后即可使得JadR1從其上游非編碼區(qū)?4到?60區(qū)脫離，隨著JdB濃度的增大JadR1從其本身啟動子上完全脫離。EMSA實驗和SPR分析表明，JdB對JadR1 DNA結(jié)合能力的影響是高度特異的，并且對之前的DNase I footprinting實驗結(jié)果進(jìn)行分析也發(fā)現(xiàn)，高濃度的發(fā)酵產(chǎn)物萃取物并沒有在 JadR1的靶基因啟動子區(qū)域形成新的空斑區(qū)，暗示 JdB可能通過直接結(jié)合 JadR1來調(diào)節(jié)JadR1的功能。JadR1是第一例被證明調(diào)控功能受到其調(diào)控代謝途徑終產(chǎn)物調(diào)控的 ARR。不僅如此，JadR1的活性還受到其參與合成的中間產(chǎn)物 2,3-dehydro-UWM6、dehydrorabelomycin和JdA的調(diào)控，表明委內(nèi)瑞拉鏈霉菌可能存在一種階段式的自調(diào)控機(jī)制：在感受到環(huán)境中的特異信號之后，短時間內(nèi)胞內(nèi)相對積累的是合成的中間產(chǎn)物，這些中間產(chǎn)物可以強(qiáng)烈的誘導(dǎo)杰多霉素合成基因簇的轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致大量合成終產(chǎn)物JdB，當(dāng)JdB積累到一定程度時，它又作為一種自調(diào)控子精密調(diào)控反饋抑制自身的合成[8]。這種調(diào)控機(jī)制的闡明對改造抗生素的調(diào)控機(jī)制，提高產(chǎn)量有指導(dǎo)意義。

3 討論與展望

研究表明典型RR的REC結(jié)構(gòu)域中5個關(guān)鍵保守的氨基酸是其接受磷酸基團(tuán)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。但是，對HP1043、FrzS等ARR的研究發(fā)現(xiàn)，ARR缺失或只有部分磷酸化及其相關(guān)位點，使其不被磷酸化，這就暗示ARR可能采用不依賴于磷酸化的機(jī)制進(jìn)行活性調(diào)節(jié)。

JadR1是一個OmpR家族的ARR，缺失典型RR中結(jié)合Mg2+的兩個氨基酸，不可以被磷酸化，采用非磷酸化的機(jī)制調(diào)控杰多霉素的合成。我們前期實驗證明JadR1是通過小分子配體介導(dǎo)的機(jī)制來實現(xiàn)其調(diào)控功能的。低濃度的JdB存在時，JadR1從自身啟動子區(qū)脫離；同時，JadR2也結(jié)合JdB，從jadR1啟動子區(qū)脫離，終止對jadR1轉(zhuǎn)錄的抑制，jadR1大量轉(zhuǎn)錄。大量的JadR1和低濃度JdB一起使得jadJ的轉(zhuǎn)錄激活得到增強(qiáng)，JdB開始大量合成。隨著JdB濃度的逐步提高，JadR1開始逐漸從jadJ啟動子上脫離，從而終止對jadJ的激活，實現(xiàn)對Jd B合成的精密調(diào)控。通過小分子配體介導(dǎo)來實現(xiàn)調(diào)控功能可能是典型磷酸化的一種替代方式。

圖3 JadR1應(yīng)答調(diào)控模式圖Fig. 3 A model of JadR1 mediated regulation of gene expression.

盡管已有充分的實驗證據(jù)證明 JadR1可與JdB結(jié)合，但JdB對JadR1聚集狀態(tài)的影響以及JadR1調(diào)控機(jī)制的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)還不清楚。典型 RR的非活性狀態(tài)是單體 (個別的是二聚體) 構(gòu)象，當(dāng)接受磷酸基團(tuán)被磷酸化后，RR的構(gòu)象發(fā)生變化，在REC結(jié)構(gòu)域之間利用α4-β5-α5界面形成有活性的二聚體構(gòu)象，然后在此構(gòu)象狀態(tài)下行使不同的調(diào)控功能。通過對HP1043、FrzS等ARR的研究發(fā)現(xiàn)，ARR可能采用一些新的構(gòu)象，例如活性與非活性構(gòu)象均為單體，單體和二聚體構(gòu)象均有活性等不同于典型RR的構(gòu)象。但是，ARR形成二聚體時，與典型RR的機(jī)理很相似，都是利用α4-β5-α5界面。通過與同源蛋白序列比對分析，推測JadR1可能也通過α4-β5-α5界面形成二聚體，但是具體構(gòu)象與活性的關(guān)系還需要實驗的驗證。

根據(jù)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的不同，鏈霉菌次級代謝合成基因簇中的ARR分為OmpR和NarL兩個家族。JadR1是最早被研究的OmpR家族的ARR[24]。OmpR家族ARR氨基酸序列較為保守，并且其編碼基因全部定位在角蒽環(huán)類抗生素或含有角蒽環(huán)類抗生素母核相似結(jié)構(gòu)的次級代謝產(chǎn)物合成基因簇中，說明它們很可能來源于同一個祖先，并且暗示它們可能執(zhí)行相似的功能。NarL家族ARR氨基酸序列不保守，其中RedZ是最早被研究的NarL家族的ARR[27]。在天藍(lán)色鏈霉菌Streptomyces coelicolor A3 (2) 中，RedZ被認(rèn)為通過激活途經(jīng)特異性調(diào)控子RedD對十一烷基靈菌紅素 (Undecylprodigiosin，Red) 的生物合成行使正調(diào)控[28]。RedZ不包含典型RR中保守的Asp，暗示RedZ很可能不具備接受磷酸基團(tuán)的能力。王琳淇等[8]的實驗表明RedZ的激活功能同樣會被其調(diào)控的終產(chǎn)物十一烷基靈菌紅素所終止，同時也說明Red對其自身的產(chǎn)生也存在著自調(diào)控的作用。因此，這種次級代謝終產(chǎn)物通過影響其合成過程中的途徑特異性調(diào)控子來精細(xì)調(diào)控自身合成的方式可能是普遍存在的，不只局限于一類抗生素、一類調(diào)節(jié)蛋白，也不只適用于鏈霉菌，這就為一些商業(yè)化的重要的次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的提高指出了新的方向。

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