王雅博 諸 凱 安 娜 王艷嬌

(1天津大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院 天津 300072)

(2天津商業(yè)大學(xué)天津市制冷技術(shù)重點實驗室 天津 300134)

1 引言

在常溫下細(xì)胞與周圍的溶液處于平衡狀態(tài)，細(xì)胞內(nèi)、外的溫度和濃度都是相同的。在冷卻過程中，當(dāng)細(xì)胞外的溶液先被冷卻到溶液的凝固點以下時，由于細(xì)胞外溶液的水分濃度增加，形成高滲透壓，促使細(xì)胞內(nèi)水分外流。當(dāng)降溫速率較慢時，細(xì)胞不斷脫水，皺縮。同時，胞外冰晶的形成，使細(xì)胞受到一定的擠壓，細(xì)胞骨架變形。當(dāng)降溫速率不足以使細(xì)胞內(nèi)水分外滲時，細(xì)胞漿會降溫過度，產(chǎn)生胞內(nèi)冰。這就是Mazur提出的“雙因素假說”［1－2］。因此降溫速率對細(xì)胞及組織的保存效果有很大的影響。通過控制降溫速率能夠延長細(xì)胞和組織的保存時間［3］。但不同細(xì)胞對溫度的敏感程度不盡相同，研究特定細(xì)胞或組織凍結(jié)過程中的損傷機(jī)理對于低溫延時保存具有重要意義。

低溫保存過程中，細(xì)胞損傷與胞內(nèi)冰的形成(IIF)具有必然聯(lián)系。對于細(xì)胞和組織保存，其胞內(nèi)冰的形成將直接導(dǎo)致細(xì)胞死亡。了解細(xì)胞胞內(nèi)冰晶的形成過程對于低溫保存方法的研究非常重要［4－5］，因此胞內(nèi)外冰晶形成溫度的測定是進(jìn)行低溫保存機(jī)理研究的基礎(chǔ)。本文采用差示掃描量熱儀和低溫顯微鏡觀察和分析小鼠腎細(xì)胞的胞內(nèi)、外冰晶形成過程。旨在了解小鼠腎細(xì)胞胞內(nèi)外冰晶的形成與降溫速率的關(guān)系。

2 實驗研究

2.1 腎活細(xì)胞懸液的制備

將BALB/C鼠脫臼處死，取出腎臟剪碎，用200目尼龍網(wǎng)研磨。然后用生理鹽水緩慢沖洗，收集細(xì)胞懸液，臺盼藍(lán)染色活細(xì)胞數(shù)在80%以上［6］。

2.2 差示掃描量熱儀

采用TA－Q1000型差示掃描量熱儀記錄樣品凍結(jié)過程中的熱流曲線。使用前用高純銦對儀器進(jìn)行溫度校準(zhǔn)得到爐子常數(shù)為1.19。實驗掃描溫度范圍為25—－60℃。

2.3 低溫顯微系統(tǒng)

低溫顯微系統(tǒng)包括光學(xué)顯微鏡和BCS－196冷熱臺及其溫度控制系統(tǒng)。顯微鏡上裝有CCD，圖像經(jīng)計算機(jī)上的圖像采集卡轉(zhuǎn)換后予以存儲。冷熱臺可實現(xiàn)－196—125℃內(nèi)升降溫速率的精確控溫，精度為0.01℃。

在進(jìn)行顯微觀察時，樣品的準(zhǔn)備尤其重要。研究采用的方法是:將一片載玻片置于另一片石英載玻片之上，利用表面張力將細(xì)胞懸液吸入至兩載玻片之間。由此得到的試樣有利于觀察胞內(nèi)冰的單層細(xì)胞(monolayer)，并且可以防止觀察過程中細(xì)胞懸液的蒸發(fā)和泄漏。

2.4 降溫程序

胞內(nèi)冰的形成是造成細(xì)胞損傷的致命原因，為了避免胞內(nèi)冰的形成，必須在細(xì)胞達(dá)到結(jié)晶溫度前，通過細(xì)胞脫水來避免胞內(nèi)過冷。降溫速度越快，胞內(nèi)溶質(zhì)的過冷度越大，當(dāng)達(dá)到成核溫度時，過冷的細(xì)胞質(zhì)就會結(jié)冰。為了研究胞內(nèi)冰形成溫度和胞外冰形成溫度與降溫速率的關(guān)系。實驗采用 2、5、10、20、30、50、100℃/min的降溫速率對腎細(xì)胞懸液進(jìn)行冷卻。每個溫度程序重復(fù)5次實驗，所得結(jié)果非常相似，取平均值作為最終的結(jié)果。

3 DSC測試胞內(nèi)冰溫度的驗證

DSC實驗中，在沒有胞內(nèi)冰產(chǎn)生的情況下，熱流曲線只有一個“大放熱峰”，代表胞外介質(zhì)冰晶形成;如果還將出現(xiàn)第二個“小放熱峰”則代表胞內(nèi)冰的產(chǎn)生。為了證實第二個“小放熱峰”即為胞內(nèi)冰產(chǎn)生的熱流曲線，設(shè)計了一個獨立的實驗。第一步，將樣品以5℃/min降溫至出現(xiàn)第一個放熱峰;第二步，將樣品升溫至0℃，并快速降溫至－50℃;第三步，重復(fù)第二步。圖1是驗證試驗的放熱曲線曲線。慢速(5℃/min)降溫至結(jié)晶溫度，又迅速升溫，意味著樣品中只產(chǎn)生了胞外冰晶，會有一個大的放熱峰出現(xiàn)。將同一樣品快速降溫，在該過程中，第一個大放熱峰出現(xiàn)之后，又產(chǎn)生一個小的放熱峰)。再次升溫－降溫，這時僅會有一個放熱峰出現(xiàn)，說明經(jīng)過快速降溫后，胞內(nèi)冰形成，細(xì)胞死亡，(低溫顯微觀察也證實:經(jīng)過快速降溫，細(xì)胞膜消失，細(xì)胞與外界基質(zhì)溶為一體，如圖2。圖2中的小圓圈即為具有活性的腎細(xì)胞，經(jīng)凍結(jié)后該“小圓圈”在視野中基本消失，說明細(xì)胞結(jié)構(gòu)已被破壞，細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜碎片與基質(zhì)溶為一體，即不再出現(xiàn)第二個“放熱峰”。所以當(dāng)快速降溫時，所出現(xiàn)的第二個“小放熱峰”即為胞內(nèi)冰的形成過程。

圖1 不同降溫速率DSC熱流曲線Fig.1 DSC thermograms of different cooling rate for same sample

圖2 快速降溫前后的細(xì)胞狀態(tài)Fig.2 Cell status before and after cooling at 200℃/min from cryomicroscope

4 結(jié)果和分析

4.1 胞外冰(EIF)的產(chǎn)生

由DSC得到的熱流－溫度曲線上，放熱峰發(fā)生的起始點，即為胞外冰產(chǎn)生的時刻，如圖1中的點A。圖3顯示了胞外冰晶的形成過程及胞外冰對細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響。在低溫顯微觀察中，隨著溫度的降低，在視野中會突然出現(xiàn)分散的冰晶，繼而冰晶會像樹枝狀生長。胞外冰生長的過程類似于玻璃破裂的過程。起初胞外冰對細(xì)胞結(jié)構(gòu)只產(chǎn)生微小的影響－細(xì)胞微小變形和旋轉(zhuǎn)。隨著胞外冰晶的增多，細(xì)胞外濃度增大，細(xì)胞內(nèi)的水分流失，細(xì)胞皺縮。但細(xì)胞內(nèi)始終沒有冰晶的產(chǎn)生。采用Image－Pro Plus軟件測量了細(xì)胞凍結(jié)脫水過程中的細(xì)胞直徑變化。未凍結(jié)時，細(xì)胞直徑為4.66 μm。隨著胞外冰的出現(xiàn)，細(xì)胞皺縮，在－10.11℃時，細(xì)胞直徑逐漸減少到3.5 μm。

圖3 2℃/min降溫情況下，細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞的變化情況Fig.3 Ice crystal process in renal cell suspensions at cooling rate 2℃/min

圖4是分別通過DSC和低溫顯微系統(tǒng)獲得的不同降溫速率下，胞外冰形成溫度。隨著降溫速率的增大，細(xì)胞外溶液過冷度逐漸增大，胞外冰形成溫度降低。當(dāng)降溫速率小于50℃/min時，降溫速率對胞外冰的形成溫度有明顯的影響。降溫速率的增大，EIF溫度顯著下降。當(dāng)降溫速率大于50℃/min，降溫速率對EIF溫度的影響并不顯著。

圖4 DSC和低溫顯微鏡測定的胞外冰形成溫度比較Fig.4 Comparison of DSC and linkam cryomicroscopy EIF temperature

4.2 胞內(nèi)冰(IIF)的產(chǎn)生

在DSC中，快速降溫將導(dǎo)致胞內(nèi)冰(第二個放熱峰)的出現(xiàn)。實驗顯示，以較小的速率進(jìn)行降溫，不會出現(xiàn)第二個放熱峰。由DSC實驗可知，在降溫速率小于10℃/min的情況下，腎細(xì)胞內(nèi)沒有冰晶的產(chǎn)生，低溫顯微觀察也證實了這一結(jié)論。圖5為DSC實驗得到的不同降溫速率，胞內(nèi)冰形成溫度。同樣的，隨著降溫速率的增大，胞內(nèi)冰的形成溫度逐漸降低。這是由于降溫速率越大，細(xì)胞內(nèi)留存水分的滲透壓不平衡性越大，導(dǎo)致細(xì)胞漿的過冷度越大。

圖5 DSC測得的胞內(nèi)冰溫度Fig.5 DSC IIF temperature at different cooling rate

眾多研究者已證實，細(xì)胞結(jié)冰后顯微鏡內(nèi)細(xì)胞的亮度明顯發(fā)生變化。在普通光學(xué)顯微鏡下，細(xì)胞區(qū)域?qū)⑼蝗换蛑鸩阶兒?darkening)［7］。圖5顯示了降溫速率為100℃/min時的觀察結(jié)果。在圖5中，由于降溫速率較大，細(xì)胞內(nèi)的水份來不及滲出。在－23.05℃時，形成胞內(nèi)冰。胞內(nèi)冰的形成破壞了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，細(xì)胞逐漸消失。表1列出了不同降溫速率下，腎細(xì)胞懸液胞內(nèi)冰和胞外冰形成溫度的差值tEIF－tIIF。tEIF－tIIF隨降溫速率的增大而增大。

圖5 100℃/min降溫情況下，細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞的變化情況Fig.5 Ice crystal process in renal cell suspensions at cooling rate100℃/min

5 總結(jié)與討論

通過可視化觀察分析可知，細(xì)胞在凍結(jié)過程中，當(dāng)胞外冰形成時，視野會突然明亮并迅速出現(xiàn)樹枝狀冰晶，L Li等人［8］也證明了這一過程。胞外冰出現(xiàn)后，視野內(nèi)細(xì)胞逐漸“變黑”，代表著胞內(nèi)冰晶的形成。

DSC是觀察測試材料相變過程(熱流變化)非常靈敏的儀器，用于對胞內(nèi)冰的探測也具有足夠的靈敏度。快速降溫時，DSC降溫曲線會出現(xiàn)兩個“放熱峰”。但是有些降溫過程并沒有出現(xiàn)第二個“小放熱峰”，可能是由于代表胞外冰產(chǎn)生的“大放熱峰”將(代表胞內(nèi)冰產(chǎn)生的)小放熱峰吸收了。

表1 不同降溫速率下tEIF，tIIF，tEIF-tIIF Table 1 tEIF，tIIF，tEIF-tIIFof different cooling rate

本文分別利用差示掃描量熱儀和低溫顯微系統(tǒng)，獲得了胞內(nèi)、外冰的形成溫度，分析了降溫速率對胞內(nèi)冰形成溫度、胞外冰形成溫度以及對這兩個溫度差值的影響?？焖俳禍啬軌蚴菇Y(jié)冰溫度(包括胞內(nèi)冰，胞外冰)降低，并能提高兩種結(jié)冰溫度的溫差。這一結(jié)論說明在細(xì)胞及組織的保存過程中，提高降溫速率，有助于獲得更低的保存溫度。研究結(jié)果對理解冰晶的形成過程和優(yōu)化保存方法具有指導(dǎo)意義。

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8 Li J，Zhang L L，Liu Q H，et al.Extra and intra－cellular ice formation of red seabream(Pagrus major)embryos at different cooling rates［J］.Cryobiology ，2009，59:48－53