王雅博 諸 凱 安 娜 王艷嬌

(1天津大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院 天津 300072)

(2天津商業(yè)大學(xué)天津市制冷技術(shù)重點實驗室 天津 300134)

1 引言

在常溫下細胞與周圍的溶液處于平衡狀態(tài)，細胞內(nèi)、外的溫度和濃度都是相同的。在冷卻過程中，當(dāng)細胞外的溶液先被冷卻到溶液的凝固點以下時，由于細胞外溶液的水分濃度增加，形成高滲透壓，促使細胞內(nèi)水分外流。當(dāng)降溫速率較慢時，細胞不斷脫水，皺縮。同時，胞外冰晶的形成，使細胞受到一定的擠壓，細胞骨架變形。當(dāng)降溫速率不足以使細胞內(nèi)水分外滲時，細胞漿會降溫過度，產(chǎn)生胞內(nèi)冰。這就是Mazur提出的“雙因素假說”［1－2］。因此降溫速率對細胞及組織的保存效果有很大的影響。通過控制降溫速率能夠延長細胞和組織的保存時間［3］。但不同細胞對溫度的敏感程度不盡相同，研究特定細胞或組織凍結(jié)過程中的損傷機理對于低溫延時保存具有重要意義。

低溫保存過程中，細胞損傷與胞內(nèi)冰的形成(IIF)具有必然聯(lián)系。對于細胞和組織保存，其胞內(nèi)冰的形成將直接導(dǎo)致細胞死亡。了解細胞胞內(nèi)冰晶的形成過程對于低溫保存方法的研究非常重要［4－5］，因此胞內(nèi)外冰晶形成溫度的測定是進行低溫保存機理研究的基礎(chǔ)。本文采用差示掃描量熱儀和低溫顯微鏡觀察和分析小鼠腎細胞的胞內(nèi)、外冰晶形成過程。旨在了解小鼠腎細胞胞內(nèi)外冰晶的形成與降溫速率的關(guān)系。

2 實驗研究

2.1 腎活細胞懸液的制備

將BALB/C鼠脫臼處死，取出腎臟剪碎，用200目尼龍網(wǎng)研磨。然后用生理鹽水緩慢沖洗，收集細胞懸液，臺盼藍染色活細胞數(shù)在80%以上［6］。

2.2 差示掃描量熱儀

采用TA－Q1000型差示掃描量熱儀記錄樣品凍結(jié)過程中的熱流曲線。使用前用高純銦對儀器進行溫度校準(zhǔn)得到爐子常數(shù)為1.19。實驗掃描溫度范圍為25—－60℃。

2.3 低溫顯微系統(tǒng)

低溫顯微系統(tǒng)包括光學(xué)顯微鏡和BCS－196冷熱臺及其溫度控制系統(tǒng)。顯微鏡上裝有CCD，圖像經(jīng)計算機上的圖像采集卡轉(zhuǎn)換后予以存儲。冷熱臺可實現(xiàn)－196—125℃內(nèi)升降溫速率的精確控溫，精度為0.01℃。

在進行顯微觀察時，樣品的準(zhǔn)備尤其重要。研究采用的方法是:將一片載玻片置于另一片石英載玻片之上，利用表面張力將細胞懸液吸入至兩載玻片之間。由此得到的試樣有利于觀察胞內(nèi)冰的單層細胞(monolayer)，并且可以防止觀察過程中細胞懸液的蒸發(fā)和泄漏。

2.4 降溫程序

胞內(nèi)冰的形成是造成細胞損傷的致命原因，為了避免胞內(nèi)冰的形成，必須在細胞達到結(jié)晶溫度前，通過細胞脫水來避免胞內(nèi)過冷。降溫速度越快，胞內(nèi)溶質(zhì)的過冷度越大，當(dāng)達到成核溫度時，過冷的細胞質(zhì)就會結(jié)冰。為了研究胞內(nèi)冰形成溫度和胞外冰形成溫度與降溫速率的關(guān)系。實驗采用 2、5、10、20、30、50、100℃/min的降溫速率對腎細胞懸液進行冷卻。每個溫度程序重復(fù)5次實驗，所得結(jié)果非常相似，取平均值作為最終的結(jié)果。

3 DSC測試胞內(nèi)冰溫度的驗證

DSC實驗中，在沒有胞內(nèi)冰產(chǎn)生的情況下，熱流曲線只有一個“大放熱峰”，代表胞外介質(zhì)冰晶形成;如果還將出現(xiàn)第二個“小放熱峰”則代表胞內(nèi)冰的產(chǎn)生。為了證實第二個“小放熱峰”即為胞內(nèi)冰產(chǎn)生的熱流曲線，設(shè)計了一個獨立的實驗。第一步，將樣品以5℃/min降溫至出現(xiàn)第一個放熱峰;第二步，將樣品升溫至0℃，并快速降溫至－50℃;第三步，重復(fù)第二步。圖1是驗證試驗的放熱曲線曲線。慢速(5℃/min)降溫至結(jié)晶溫度，又迅速升溫，意味著樣品中只產(chǎn)生了胞外冰晶，會有一個大的放熱峰出現(xiàn)。將同一樣品快速降溫，在該過程中，第一個大放熱峰出現(xiàn)之后，又產(chǎn)生一個小的放熱峰)。再次升溫－降溫，這時僅會有一個放熱峰出現(xiàn)，說明經(jīng)過快速降溫后，胞內(nèi)冰形成，細胞死亡，(低溫顯微觀察也證實:經(jīng)過快速降溫，細胞膜消失，細胞與外界基質(zhì)溶為一體，如圖2。圖2中的小圓圈即為具有活性的腎細胞，經(jīng)凍結(jié)后該“小圓圈”在視野中基本消失，說明細胞結(jié)構(gòu)已被破壞，細胞質(zhì)、細胞膜碎片與基質(zhì)溶為一體，即不再出現(xiàn)第二個“放熱峰”。所以當(dāng)快速降溫時，所出現(xiàn)的第二個“小放熱峰”即為胞內(nèi)冰的形成過程。

圖1 不同降溫速率DSC熱流曲線Fig.1 DSC thermograms of different cooling rate for same sample

圖2 快速降溫前后的細胞狀態(tài)Fig.2 Cell status before and after cooling at 200℃/min from cryomicroscope

4 結(jié)果和分析

4.1 胞外冰(EIF)的產(chǎn)生

由DSC得到的熱流－溫度曲線上，放熱峰發(fā)生的起始點，即為胞外冰產(chǎn)生的時刻，如圖1中的點A。圖3顯示了胞外冰晶的形成過程及胞外冰對細胞結(jié)構(gòu)的影響。在低溫顯微觀察中，隨著溫度的降低，在視野中會突然出現(xiàn)分散的冰晶，繼而冰晶會像樹枝狀生長。胞外冰生長的過程類似于玻璃破裂的過程。起初胞外冰對細胞結(jié)構(gòu)只產(chǎn)生微小的影響－細胞微小變形和旋轉(zhuǎn)。隨著胞外冰晶的增多，細胞外濃度增大，細胞內(nèi)的水分流失，細胞皺縮。但細胞內(nèi)始終沒有冰晶的產(chǎn)生。采用Image－Pro Plus軟件測量了細胞凍結(jié)脫水過程中的細胞直徑變化。未凍結(jié)時，細胞直徑為4.66 μm。隨著胞外冰的出現(xiàn)，細胞皺縮，在－10.11℃時，細胞直徑逐漸減少到3.5 μm。

圖3 2℃/min降溫情況下，細胞外基質(zhì)及細胞的變化情況Fig.3 Ice crystal process in renal cell suspensions at cooling rate 2℃/min

圖4是分別通過DSC和低溫顯微系統(tǒng)獲得的不同降溫速率下，胞外冰形成溫度。隨著降溫速率的增大，細胞外溶液過冷度逐漸增大，胞外冰形成溫度降低。當(dāng)降溫速率小于50℃/min時，降溫速率對胞外冰的形成溫度有明顯的影響。降溫速率的增大，EIF溫度顯著下降。當(dāng)降溫速率大于50℃/min，降溫速率對EIF溫度的影響并不顯著。

圖4 DSC和低溫顯微鏡測定的胞外冰形成溫度比較Fig.4 Comparison of DSC and linkam cryomicroscopy EIF temperature

4.2 胞內(nèi)冰(IIF)的產(chǎn)生

在DSC中，快速降溫將導(dǎo)致胞內(nèi)冰(第二個放熱峰)的出現(xiàn)。實驗顯示，以較小的速率進行降溫，不會出現(xiàn)第二個放熱峰。由DSC實驗可知，在降溫速率小于10℃/min的情況下，腎細胞內(nèi)沒有冰晶的產(chǎn)生，低溫顯微觀察也證實了這一結(jié)論。圖5為DSC實驗得到的不同降溫速率，胞內(nèi)冰形成溫度。同樣的，隨著降溫速率的增大，胞內(nèi)冰的形成溫度逐漸降低。這是由于降溫速率越大，細胞內(nèi)留存水分的滲透壓不平衡性越大，導(dǎo)致細胞漿的過冷度越大。

圖5 DSC測得的胞內(nèi)冰溫度Fig.5 DSC IIF temperature at different cooling rate

眾多研究者已證實，細胞結(jié)冰后顯微鏡內(nèi)細胞的亮度明顯發(fā)生變化。在普通光學(xué)顯微鏡下，細胞區(qū)域?qū)⑼蝗换蛑鸩阶兒?darkening)［7］。圖5顯示了降溫速率為100℃/min時的觀察結(jié)果。在圖5中，由于降溫速率較大，細胞內(nèi)的水份來不及滲出。在－23.05℃時，形成胞內(nèi)冰。胞內(nèi)冰的形成破壞了細胞膜結(jié)構(gòu)，細胞逐漸消失。表1列出了不同降溫速率下，腎細胞懸液胞內(nèi)冰和胞外冰形成溫度的差值tEIF－tIIF。tEIF－tIIF隨降溫速率的增大而增大。

圖5 100℃/min降溫情況下，細胞外基質(zhì)及細胞的變化情況Fig.5 Ice crystal process in renal cell suspensions at cooling rate100℃/min

5 總結(jié)與討論

通過可視化觀察分析可知，細胞在凍結(jié)過程中，當(dāng)胞外冰形成時，視野會突然明亮并迅速出現(xiàn)樹枝狀冰晶，L Li等人［8］也證明了這一過程。胞外冰出現(xiàn)后，視野內(nèi)細胞逐漸“變黑”，代表著胞內(nèi)冰晶的形成。

DSC是觀察測試材料相變過程(熱流變化)非常靈敏的儀器，用于對胞內(nèi)冰的探測也具有足夠的靈敏度。快速降溫時，DSC降溫曲線會出現(xiàn)兩個“放熱峰”。但是有些降溫過程并沒有出現(xiàn)第二個“小放熱峰”，可能是由于代表胞外冰產(chǎn)生的“大放熱峰”將(代表胞內(nèi)冰產(chǎn)生的)小放熱峰吸收了。

表1 不同降溫速率下tEIF，tIIF，tEIF-tIIF Table 1 tEIF，tIIF，tEIF-tIIFof different cooling rate

本文分別利用差示掃描量熱儀和低溫顯微系統(tǒng)，獲得了胞內(nèi)、外冰的形成溫度，分析了降溫速率對胞內(nèi)冰形成溫度、胞外冰形成溫度以及對這兩個溫度差值的影響。快速降溫能夠使結(jié)冰溫度(包括胞內(nèi)冰，胞外冰)降低，并能提高兩種結(jié)冰溫度的溫差。這一結(jié)論說明在細胞及組織的保存過程中，提高降溫速率，有助于獲得更低的保存溫度。研究結(jié)果對理解冰晶的形成過程和優(yōu)化保存方法具有指導(dǎo)意義。

1 Mazur P.Freezing of living cells:Mechanisms and implications［J］.American Journal of Physiology，1984，247:125－142

2 趙 剛，楊基明，何立群，等，離子水合對胞內(nèi)冰成核與生長的影響［J］.自然科學(xué)進展，2005，15(3):372－374

3 Nerem R M.Tissue engineering:confronting the transplantation crisis，Proceedings of Institution of Mechanical Engineers，Part H:Journal of Engineering in Medicine，2000，214:95－99.

4 Mazur P.Kinetics of water loss from cells at subzero temperatures and likelihood of intracellular freezing［J］.The Journal of General Physiology，1963，47:347－369.

5 劉寶林，John McGranth，華澤釗.低溫保存過程中老鼠成骨細胞胞內(nèi)冰的研究［J］.制冷學(xué)報，2007，28(1):22－25

6 彭 宇，鄭清蓮，李信民等，胎腎細胞懸液對卵巢大鼠自由基的影響［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2010，30(4):416－418

7 張紹志，王 葳，陳光明，等.低溫顯微裝置及其對細胞胞內(nèi)冰晶形成現(xiàn)象的觀察［J］.細胞生物學(xué)雜志，2003(4):231－234

8 Li J，Zhang L L，Liu Q H，et al.Extra and intra－cellular ice formation of red seabream(Pagrus major)embryos at different cooling rates［J］.Cryobiology ，2009，59:48－53