李文霞 寧海龍 張永根 白雅梅 石 瑛 魏峭嶸 張麗莉呂文河*
(1 東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院,黑龍江哈爾濱 150030;2 東北農(nóng)業(yè)大學動物科技學院,黑龍江哈爾濱150030;3 東北農(nóng)業(yè)大學資環(huán)學院,黑龍江哈爾濱 150030)
馬鈴薯(Solanum tuberosumL.)是糧菜兼用型作物,也是僅次于小麥、水稻、玉米的世界第四大糧食作物,具有生育期短、適應性強、營養(yǎng)豐富、高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)、產(chǎn)業(yè)鏈長、開發(fā)利用前景廣闊等特點。二倍體馬鈴薯中有許多非常寶貴的性狀,如高干物質(zhì)含量、低還原糖含量、高蛋白含量,抗霜凍、抗鹽堿、抗寒、抗旱、耐熱等能力較強。因此,以花藥培養(yǎng)為橋梁進行二倍體馬鈴薯孤雄生殖有望獲得馬鈴薯新資源。
印度德里大學的學者Guha 和Maheshwari(1964)以理解減數(shù)分裂的機制為目的,培養(yǎng)曼陀羅花藥時,發(fā)現(xiàn)花藥花粉形成胚,進而被誘導形成單倍體植株。我國學者在花藥培養(yǎng)方面進行了廣泛的研究,取得了許多重要的理論與實踐成果。如在花椰菜(張曉芬 等,2005)、甘藍(方淑桂 等,2006)、觀賞茄(宋明 等,2005)、羽衣甘藍(鄒金美 等,2005)、剛果12 號桉(李守嶺和莊南生,2006)、中國水仙(張清國 等,2010)等植物上通過花藥培養(yǎng)獲得單倍體植株,但在實際應用中均存在產(chǎn)胚率低等諸多問題。朱明凱等(1985)從馬鈴薯愈傷組織分化出的苗有混倍體(2n=28、32)、雙單倍體(2n=24)和四倍體(2n=48),而從胚狀體誘導成苗的均為雙單倍體(2n=24)。戴朝曦等(1993)首次報道了用花藥培養(yǎng)法由馬鈴薯一個典型的雄性不育雙單倍體甘花雙7 號誘導產(chǎn)生一單倍體,植株之間表現(xiàn)出明顯的性狀分離,經(jīng)鑒定具有典型的一單倍體特征。冉毅東等(1996)用3 種不同溫度的前處理對馬鈴薯雙單倍體進行花藥培養(yǎng),倍性鑒定結(jié)果表明,從雙單倍體誘導的胚狀體分化的植株絕大多數(shù)為純合二倍體,可能是胚狀體在發(fā)育過程中體細胞染色體自發(fā)加倍。梁彥濤等(2006)研究馬鈴薯花藥培養(yǎng)影響因素時發(fā)現(xiàn)馬鈴薯花藥培養(yǎng)對基因型依賴性很大。
馬鈴薯的花藥培養(yǎng)多以四倍體為研究對象,獲得的雙單倍體仍為雜合體,限制了很多隱性基因的表達,為此前人的研究是由馬鈴薯四倍體普通栽培種誘導雙單倍體,再由雙單倍體誘導一單倍體(戴朝曦 等,1993)。本試驗以具有優(yōu)良性狀的二倍體馬鈴薯為試驗材料,通過一步誘導就可以獲得一單倍體,以達到即簡化花藥培養(yǎng)程序又能利用二倍體資源優(yōu)良性狀的目標。
試驗材料為原始二倍體馬鈴薯栽培種S.phureja-S.stenotomum(PHU-STN),經(jīng)選擇適應長日照的無性系雜種61 份:BD1-2、BD1-5、BD2-2、BD4-6、BD5-7、BD6-8、BD8-2、BD8-4、BD10-4、BD10-7、BD10-8、BD11-8、BD12-5、BD12-7、BD14-2、BD15-1、BD16-4、BD17-3、BD18-8、BD21-1、BD22-3、BD24-6、BD26-6、BD29-1、BD29-3、BD31-3、BD32-9、BD34-4、BD35-4、BD35-7、BD36-4、BD38-7、BD39-3、BD40-2、BD40-7、BD41-2、BD41-7、BD42-5、BD44-5、BD45-3、BD46-1、BD46-7、BD48-2、BD51-4、BD53-9、BD54-8、BD55-3、BD57-3、BD58-7、BD60-3、BD60-6、BD62-1、BD62-2、BD62-7、BD63-2、BD64-8、BD64-9、BD65-8、BD68-6、BD69-4、BD72-9,均由東北農(nóng)業(yè)大學馬鈴薯研究所保存。
試驗試劑均購自哈爾濱伊事達生物公司,試驗儀器為博訊SW-CJ-2F(D)垂直吹風有擋板超凈工作臺、博訊YXQ-LS-50S11 高壓滅菌器。在東北農(nóng)業(yè)大學馬鈴薯研究所組培室培養(yǎng)材料,溫度為25 ℃,光暗周期為16 h/8 h。
1.2.1 試驗材料種植 61 份材料于2008年4月20日播種于東北農(nóng)業(yè)大學馬鈴薯網(wǎng)棚、東北農(nóng)業(yè)大學香坊試驗實習基地、黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院克山馬鈴薯研究所試驗基地、大興安嶺地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所試驗基地,單行區(qū),行長2 m,行距0.65 m,株距0.30 m,每行7 株,6月23日開始采集花藥。
2008年篩選出的適合基因型BD10-7、BD40-2、BD54-8、BD46-7、BD29-1、BD12-7,于2009年4月23日播種于東北農(nóng)業(yè)大學馬鈴薯網(wǎng)棚、東北農(nóng)業(yè)大學香坊試驗實習基地,6月26日開始采集花藥。
1.2.2 適宜基因型的篩選 將花藥接種在基礎(chǔ)愈傷組織誘導培養(yǎng)基 MS+0.5 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-1KT+0.5 mg·L-12,4-D+60 g·L-1蔗糖+7 g·L-1瓊脂(pH 5.8)上(王梓全 等,2007),每處理接種600 個花藥,30 d 后調(diào)查誘導出愈傷組織的花藥外植體數(shù)目以統(tǒng)計愈傷組織誘導率。60 d 后調(diào)查花藥愈傷組織上分化的綠苗數(shù)目以統(tǒng)計再生植株分化率。
愈傷組織誘導率(%)=(產(chǎn)生愈傷組織的花藥數(shù)/接種花藥數(shù))×100%
再生植株分化率(%)=(再生植株數(shù)/接種花藥數(shù))×100%
1.2.3 花藥預處理的篩選 以基因型BD10-7為試驗材料,根據(jù)前人研究成果(張曉芬 等,2005;鄒金美 等,2005;王梓全 等,2007;張清國 等,2010),本試驗設(shè)計進行4 ℃低溫、35 ℃熱激、離心和0.5 mol·L-1甘露醇預處理的L16(45)正交試驗設(shè)計(表1)。其中前2項處理設(shè)4 個水平,分別為0、2、4、6 d;離心處理30 min,轉(zhuǎn)速4 個水平分別為2 000、4 000、6 000、8 000 r·min-1;甘露醇預處理為在無菌條件下剝出花藥,浸泡于已滅菌的甘露醇中,分4 個水平0、1、2、3 d,正交設(shè)計表見表1。3 次重復,每處理120 個花藥,15 d 后調(diào)查出現(xiàn)褐化現(xiàn)象的花藥數(shù)目以統(tǒng)計花藥褐化率。30 d 后統(tǒng)計愈傷組織誘導率。
褐化率(%)=(褐化花藥數(shù)/接種花藥數(shù))×100%
1.2.4 激素配比的優(yōu)化 選用基因型BD40-2為試驗材料,在誘導培養(yǎng)基中添加不同的激素組合,激素配比見表2。15 d 后統(tǒng)計花藥褐化率,30 d 后統(tǒng)計愈傷組織誘導率。
1.2.5 碳源的篩選 選用基因型BD54-8 為試驗材料,參照前人研究成果(王梓全 等,2007;周旭紅 等,2011),本試驗進行碳源處理為:處理1(CK),添加6%蔗糖;處理2,添加3%麥芽糖;處理3,添加6%麥芽糖;處理4,添加9%麥芽糖。15 d 后統(tǒng)計花藥褐化率,30 d后統(tǒng)計愈傷組織誘導率。
1.2.6 乙烯拮抗劑的篩選 以基因型BD10-7 為試驗材料,參考袁華玲等(2008)研究結(jié)果,乙烯拮抗劑設(shè)3 個處理:處理1(CK),不添加乙烯拮抗劑;處理2,添加50 mg·L-1AgNO3;處理3,添加1 mmol·L-1硫代硫酸銀(STS)。每瓶接種花藥40 個,每處理接種6 瓶,3 次重復。15 d 后統(tǒng)計花藥褐化率,30 d 后統(tǒng)計愈傷組織誘導率。
表1 低溫、熱激、離心轉(zhuǎn)速、甘露醇預處理的L16(45)正交設(shè)計
表2 激素配比的優(yōu)化
對1.2.2、1.2.4、1.2.5、1.2.6 統(tǒng)計3 次重復的平均數(shù),對1.2.3 進行數(shù)據(jù)的反正弦轉(zhuǎn)換,之后進行方差分析(寧海龍,2012)。全部試驗數(shù)據(jù)應用SAS 9.0 統(tǒng)計軟件進行分析。
61 份材料中共有13 個基因型能夠誘導出愈傷組織(圖1-A),愈傷組織誘導率見表3。從表3 可以看出,這13 個基因型中BD60-3、BD46-1、BD54-8 愈傷誘導率最高,達到3.33%,其次為BD40-2、BD10-7 和BD64-8,分別為2.17%、1.67%和1.33%。在這13 個基因型中,有6個能夠分化出再生植株(圖1-B),其中再生植株分化率最高的是BD40-2,達到10.00%,其次為BD54-8 和BD12-7,分別為3.33%和1.67%。綜合上述分析,基因型BD40-2、BD54-8 和BD10-7 為二倍體花藥培養(yǎng)最適基因型。
圖1 馬鈴薯花藥誘導的組織愈傷和再生植株
預處理各因素對馬鈴薯花藥培養(yǎng)褐化和誘導的影響見表4。各因素對花藥培養(yǎng)褐化率和誘導率的F值均達到極顯著水平,說明各因素對降低二倍體馬鈴薯花藥培養(yǎng)的褐化率和提高誘導率有極顯著效應。各因素對褐化率的影響為熱激>離心>甘露醇>低溫,而各因素對誘導率的影響為低溫>熱激>甘露醇>離心。
預處理各因素各水平對馬鈴薯花藥培養(yǎng)褐化率的影響見表5。低溫預處理6 d 的褐化率顯著低于低溫預處理0、2、4 d,但低溫預處理0、2、4 d 3 個處理之間差異不顯著;熱激預處理4 d 的褐化率極顯著低于其他處理,熱激預處理0、2 d 之間差異不顯著,但顯著低于熱激預處理6 d;離心預處理4 000 r·min-1的褐化率極顯著低于離心預處理2 000、6 000、8 000 r·min-1,但離心預處理2 000、6 000、8 000 r·min 3 個處理之間差異不顯著;甘露醇預處理2 d 的褐化率極顯著低于甘露醇預處理3 d,但與甘露醇預處理0、1 d 之間差異不顯著。
預處理各因素各水平對馬鈴薯花藥培養(yǎng)誘導率的影響見表6。低溫預處理6 d 的誘導率極顯著高于低溫預處理0、2、4 d,但低溫預處理0、2、4 d 3 個處理之間差異不顯著;熱激預處理4d 的誘導率極顯著高于其他熱激預處理,熱激預處理2 d 的誘導率顯著高于熱激預處理6 d,但熱激預處理0、2 d 之間差異不顯著;離心預處理4 000 r·min-1的誘導率極顯著高于其他離心預處理;甘露醇預處理2 d 的誘導率極顯著高于甘露醇預處理0、1、3 d,甘露醇預處理1 d 的誘導率顯著高于甘露醇預處理3 d。
表3 不同基因型對馬鈴薯花藥培養(yǎng)愈傷誘導和植株再生的影響
表4 不同預處理對馬鈴薯花藥培養(yǎng)褐化率、誘導率影響的方差分析
表5 預處理各因素對馬鈴薯花藥培養(yǎng)褐化率的影響
表6 預處理各因素對馬鈴薯花藥培養(yǎng)誘導率的影響
試驗中發(fā)現(xiàn)褐化程度沒有達到死亡狀態(tài)的花藥仍能誘導出愈傷(圖2),因此通過上述分析,確定最佳的預處理組合為低溫6 d、熱激4 d、離心4 000 r·min-1、甘露醇2 d。
由表7 可以看出,2,4-D 為1.0 mg·L-1、6-BA 為0.2 mg·L-1的激素配比(處理6)的馬鈴薯花藥褐化率最低,為85.13%,但該配比的誘導率為1.90%,僅高于處理2 和處理3。2,4-D 為1.0 mg·L-1、6-BA 為0.1 mg·L-1的激素配比(處理5)的馬鈴薯花藥褐化率在各處理中較低,僅高于處理6,但該配比的誘導率為10.56%,在所有處理中最高。
圖2 馬鈴薯褐化花藥誘導的愈傷
碳源及濃度水平的篩選結(jié)果見表 8。麥芽糖濃度為 3%時,馬鈴薯花藥褐化率最低,為93.23%,而誘導率較高,達到2.60%,高于對照;麥芽糖濃度為9%時,馬鈴薯花藥褐化率低于對照,為97.91%,而誘導率最高,達到2.69%。由于麥芽糖濃度為3%和9%兩個水平對花藥培養(yǎng)的影響差異不大,為節(jié)約成本,本試驗選用麥芽糖濃度為3%的水平。
不同處理對二倍體馬鈴薯花藥培養(yǎng)褐化和誘導的影響方差分析表明(表9),培養(yǎng)基中不添加乙烯拮抗劑、添加50 mg·L-1AgNO3和添加1 mmol·L-1STS 對褐化和誘導影響的F值分別為12.01 和44.07,均達到顯著水平,說明培養(yǎng)基中添加乙烯拮抗劑對降低二倍體馬鈴薯花藥培養(yǎng)的愈傷褐化率和提高愈傷誘導率均有顯著效應。
乙烯拮抗劑處理對馬鈴薯花藥培養(yǎng)褐化的影響見表 10。培養(yǎng)基中添加 50 mg·L-1AgNO3處理和添加1 mmol·L-1STS 處理的褐化花藥數(shù)均與對照差異達到顯著水平,但這2 個處理之間差異不顯著。3 個處理誘導愈傷組織數(shù)之間差異顯著。培養(yǎng)基中添加1 mmol·L-1STS 誘導的愈傷組織數(shù)顯著高于培養(yǎng)基中添加50 mg·L-1AgNO3。
表7 不同激素配比對馬鈴薯花藥培養(yǎng)愈傷褐化和愈傷誘導的影響
表8 不同碳源對馬鈴薯花藥培養(yǎng)愈傷褐化和愈傷誘導的影響
表9 乙烯拮抗劑對馬鈴薯花藥褐化和愈傷誘導影響的方差分析
表10 不同乙烯拮抗劑對馬鈴薯花藥培養(yǎng)愈傷褐化和愈傷誘導的影響
本試驗以篩選的適宜基因型進行后續(xù)不同處理的各項研究,因材料資源的限制,不同的試驗處理選用的基因型材料不一致。但每項處理所用的材料均為適宜花藥培養(yǎng)的基因型,因此得出的試驗結(jié)論能夠代表該項處理的試驗結(jié)果?;蛐褪怯绊戱R鈴薯花藥培養(yǎng)效率的一個主要因子,研究表明(盧翠華 等,2005;梁彥濤 等,2006),花粉植株的誘導率與供試材料的基因型有很大關(guān)系。本試驗結(jié)果與前人的研究結(jié)果一致,從61 份基因型中篩選出6 份適合花藥培養(yǎng)的基因型。
培養(yǎng)前對花藥進行預處理,實質(zhì)上是對其進行某種形式的脅迫,通過外界逆境因素的刺激,促使花藥內(nèi)離體小孢子完成從活體內(nèi)配子體發(fā)育轉(zhuǎn)為離體下的孢子體發(fā)育,即脫分化啟動(Pechan & Keller,1988)。本試驗發(fā)現(xiàn)各因素對褐化率的影響為熱激>離心>甘露醇>低溫,而各因素對誘導率的影響為低溫>熱激>甘露醇>離心,這導致如果單純以褐化率或誘導率為指標的矛盾現(xiàn)象,因此根據(jù)試驗中的具體情況,褐化程度沒有達到死亡狀態(tài)的花藥仍能誘導出愈傷,綜合考慮褐化率和誘導率兩項指標確定最佳的預處理為低溫6 d、熱激4 d、離心4 000 r·min-1、甘露醇處理2 d。
培養(yǎng)基中激素的種類、用量和配比對誘發(fā)小孢子啟動、分裂、生長和分化具有作用(周旭紅 等,2011)。2,4-D 對許多作物花粉的啟動、分裂、形成愈傷組織和胚狀體起著決定性的作用(陳曉 等,2003)。單一激素成分培養(yǎng)的效果較差,合理的激素配比是保證組培效果的基礎(chǔ)(周旭紅 等,2011)。本試驗中發(fā)現(xiàn)1.0 mg·L-12,4-D、0.1 mg·L-16-BA 的激素配比的花藥愈傷誘導率最高。戴朝曦(1991)認為6%的蔗糖濃度有利于多數(shù)馬鈴薯材料的胚狀體發(fā)生,這可能與花粉細胞或體細胞的滲透壓有關(guān),但濃度過高也不利于愈傷組織的誘導。本試驗發(fā)現(xiàn)麥芽糖濃度為3%較適合愈傷的誘導。
褐化是花藥死亡的主要因素(冉毅東和戴朝曦,1993),本試驗首次將STS 引入到馬鈴薯的花藥培養(yǎng)中。研究發(fā)現(xiàn)盡管培養(yǎng)基中添加AgNO3和STS 對降低花藥的褐化率差異不顯著,但對提高花藥培養(yǎng)的愈傷誘導率差異顯著。筆者認為同預處理的效應一樣,輕度褐化的花藥也能誘導愈傷。應振土和陳昆松(1990)認為,低濃度的STS 對植物組織沒有毒害作用,但它卻有效地抑制了乙烯的生物學作用。而AgNO3在抑制乙烯生物學作用的同時,對原生質(zhì)的本身有毒害作用。因此本試驗認為STS 對花藥的毒害作用要小于AgNO3,這與前人的研究結(jié)果一致。
陳曉,詹玉絲,徐小利,齊衛(wèi)強,常高正,郅玉寶,易明林,呂淑玉.2003.花藥培養(yǎng)建立辣椒DH 純系的初步研究.河南農(nóng)業(yè)科學,(9):52-55.
戴朝曦.1991.生物工程技術(shù)在馬鈴薯遺傳育種研究中的應用.馬鈴薯雜志,5(3):161-166.
戴朝曦,于品華,冉毅東,曲秀蘭.1993.用花藥培養(yǎng)法由馬鈴薯雄性不育雙單倍體誘導一單倍體植株的研究.遺傳學報,20(2):141-146.
方淑桂,陳文輝,曾小玲,朱朝輝,廖曉珍,鄭學立.2006.結(jié)球甘藍游離小孢子培養(yǎng)及植株再生.園藝學報,33(1):158-160.
李守嶺,莊南生.2006.剛果12 號桉花藥愈傷組織誘導初報.熱帶農(nóng)業(yè)科技,29(1):13-16.
梁彥濤,邸宏,盧翠華,陳伊里,石瑛,王梓全.2006.馬鈴薯花藥培養(yǎng)影響因素的研究.東北農(nóng)業(yè)大學學報,37(5):604-609.
盧翠華,梁彥濤,石瑛.2005.四倍體馬鈴薯的花藥培養(yǎng)//陳伊里,屈冬玉.馬鈴薯產(chǎn)業(yè)與東北振興.哈爾濱:哈爾濱工程大學出版社.
寧海龍.2012.田間試驗與統(tǒng)計方法.北京:科學出版社:154-157.
冉毅東,戴朝曦.1993.馬鈴薯花藥培養(yǎng)硝酸銀對誘導雙單倍體及一單倍體的效果.西北農(nóng)業(yè)學報,2(4):43-47.
冉毅東,王蒂,戴朝曦.1996.提高馬鈴薯雙單倍體花藥培養(yǎng)產(chǎn)生胚狀體及再生植株頻率的研究.馬鈴薯雜志,10(2):74-78.
宋明,湯青林,鄒建,李渝,劉榮.2005.不同因素對觀賞茄花藥愈傷組織誘導的影響.西南農(nóng)業(yè)大學學報,27(4):534-536.
王梓全.2007.馬鈴薯花藥培養(yǎng)再生植株的誘導與鑒定〔碩士論文〕.哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學.
應振土,陳昆松.1990.乙烯拮抗劑 —— 硫代硫酸銀的生理作用.植物生理學通訊,(1):63-64.
袁華玲,金黎平,黃三文,謝開云,李穎,屈冬玉.2008.硫代硫酸銀對二倍體馬鈴薯試管苗生長和生理特性的影響.作物學報,34(5):846?850.
張清國,黃敏玲,葉秀仙.2010.中國水仙花藥培養(yǎng)及植株再生體系建立.分子植物育種,8(2):399-404.
張曉芬,王曉武,張延國,劉運霞,王永清.2005.花椰菜游離小孢子培養(yǎng)再生植株研究.中國蔬菜,(1):16-17.
周旭紅,莫錫君,蔣亞蓮,吳旻,龍江,李榮,桂敏.2011.激素、蔗糖濃度和取材時間對洋桔?;ㄋ幣囵B(yǎng)的影響.江蘇農(nóng)業(yè)科學,39(2):98-100.
鄒金美,張國廣,潘一山.2005.羽衣甘藍花藥培養(yǎng)技術(shù)體系的研究.漳州師范學院學報,(2):94-97.
朱明凱,程天慶,高湘玲,高秀云,宋伯符,吳紹巖,田翠萍.1985.早熟馬鈴薯四倍體栽培種花藥誘導成株.園藝學報,12(3):172-180.
Guha S,Maheshwari S C.1964.In vitroproduction of embryos from anthers ofDatura.Nature,204:497.
Pechan P M,Keller W A.1988.Identification of potentially embryogenic microspores inBrassica napus.Physiol Plant,74(2):377-384.