霍貴成，崔 蘭，劉 飛,3

（1.乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030；3.丹尼斯克（中國）有限公司，江蘇 昆山 215300）

隨著酸奶品種與營養(yǎng)價(jià)值的不斷增加，酸奶保質(zhì)期短的問題亟待解決[1]。酸奶是含益生菌的乳制品，正常發(fā)酵結(jié)束后，在產(chǎn)品貯存、運(yùn)輸、銷售、食用前這一過程中發(fā)生后酸化現(xiàn)象時(shí)會(huì)出現(xiàn)過酸味及感官質(zhì)量下降，影響酸奶保質(zhì)期[2]。德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus）具有很強(qiáng)的產(chǎn)酸能力和耐酸性，當(dāng)外界pH降低時(shí)，胞內(nèi)pH也在降低，德氏乳桿菌保加利亞亞種細(xì)胞質(zhì)膜中的質(zhì)子泵（H+－ATPase）能夠通過將胞內(nèi)質(zhì)子泵出胞外來提高胞內(nèi)的pH，形成跨膜的pH梯度差，從而使代謝酶的活力不受影響，使其在低pH下仍然能夠生長(zhǎng)。因此，可以通過改變H+－ATPase的活性來控制酸奶的后酸化。本文利用新霉素來篩選H+－ATPase缺陷的德氏乳桿菌保加利亞亞種自發(fā)突變菌株，并對(duì)其酸應(yīng)激和冷應(yīng)激特性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種：德氏乳桿菌保加利亞亞種KLDS1.9201來源于乳品工業(yè)微生物菌種保藏中心（DICC）。培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基和12%（W/V）脫脂乳培養(yǎng)基。試劑：新霉素（購自Amresco公司）；BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒（購自碧云天公司）；其他化學(xué)試劑均為分析純。

主要儀器：紫外分光光度計(jì)DU－800（Beckman公司）；680型酶標(biāo)儀（美國伯樂）；DHP－9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海－恒科技）；飛鴿離心機(jī)GL－20G－Ⅱ。

1.2 方法

1.2.1 H+－ATPase缺陷突變菌株的篩選

將菌株KLDS1.9201用MRS培養(yǎng)基活化2次，第3代在37℃下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，取0.1 mL菌液涂布于含有300 μg·mL－1新霉素的MRS平板上，37 ℃培養(yǎng)72～96 h，選取單菌落接種于液體MRS培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h，然后涂布于含有新霉素（300 μg·mL－1）的MRS平板上。37 ℃培養(yǎng)72 h后，選取單菌落接種于 MRS 液體培養(yǎng)基（300 μg·mL－1），37℃培養(yǎng)48 h后測(cè)定菌液的pH和600 nm下的吸光值，只有OD600nm＜0.8和pH＞4.2的突變株被用于進(jìn)一步的研究，將其在含有新霉素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一代，再將此突變株置于終濃度10%的滅菌甘油中，在－80℃下保存[3]。

將親本菌株KLDS1.9201和突變菌株KLDS 1.9201－11以3%接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)，每隔2 h測(cè)定發(fā)酵液的pH和OD600nm。

1.2.3 菌株酸耐受力的測(cè)定

將親本菌株KLDS1.9201和突變菌株KLDS 1.9201－11接種于MRS液體培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)10 h，分別取30 mL菌液，10 mL用于制備透性細(xì)胞，其余 20 mL菌液 6 000 r·min－1，離心 20 min后，菌泥分別分散到等體積的普通MRS液體培養(yǎng)基和pH 3.0的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃作用3 h[4]。作用前后分別取樣，采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)并測(cè)定H+－ATPase活力。

1.2.4 菌株冷耐受力的測(cè)定

將親本菌株KLDS1.9201和突變菌株KLDS 1.9201－11接種于MRS液體培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)18 h，分別取20 mL菌液，10 mL用于制備透性細(xì)胞，其余10 mL菌液，6 000 r·min－1，離心20 min，收集的菌體用等體積的PBS緩沖液洗脫，6 000 r·min－1，離心20 min，重復(fù)兩次。將收集的菌體分散于10 mL脫脂乳培養(yǎng)基中，混勻后分裝于安培瓶中凍干。凍干前后分別取樣，采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)并測(cè)定H+－ATPase活力。將凍干好的菌粉接種于10 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18 h后用于制作冷應(yīng)激后的透性細(xì)胞。

1.2.5 透性細(xì)胞的制備

按照Mitsuharu等的方法制備透性細(xì)胞，對(duì)其中部分步驟進(jìn)行了修改[4]。分別取親本菌株KLDS 1.9201和突變菌株KLDS1.9201－11的10 mL菌液在6 000 r·min－1下，離心 20 min，收集菌體，加入500 μL Tris－HCl緩沖液（75 mmol·L－1，含 10 mmol·L－1MgSO4）和50 μL甲苯，用力攪拌直至均勻，37℃靜置5 min。將菌懸液至于－80℃中冷凍2 h，取出后再置于37℃中靜置5 min，如此反復(fù)兩次后在6 000 r·min－1下，離心20 min，收集透性細(xì)胞，用400 μL Tris－HCl緩沖液懸浮透性細(xì)胞，然后將菌懸液迅速冷凍到－80℃中，貯存?zhèn)溆谩?/p>

與案例教學(xué)相比，傳統(tǒng)教學(xué)有綱可循、有綱可依，只要按教學(xué)大綱開展教學(xué)，嚴(yán)格把握教學(xué)內(nèi)容，就可滿足對(duì)基礎(chǔ)知識(shí)和技能的教學(xué)要求。案例教學(xué)則要求教師根據(jù)不同專業(yè)的特點(diǎn)，自行設(shè)計(jì)教學(xué)案例，其方式與內(nèi)容均不固定，不單一。這既是案例教學(xué)的魅力和特征所在，也在客觀上加大了教學(xué)的難度和不確定性。因此，教師授課過程中應(yīng)嚴(yán)格、負(fù)責(zé)地把控課堂教學(xué)關(guān)，切實(shí)保障課堂教學(xué)質(zhì)量，讓學(xué)生從具體案例中學(xué)有所得。

1.2.6 H+－ATPase酶活力的測(cè)定

依照 Belli和 Ongol等的方法[5－6]測(cè)定酶活，并對(duì)其中部分進(jìn)行了改進(jìn)。在未添加Na2ATP時(shí)，將反應(yīng)混和液（3 mL）在37℃下溫育20 min，然后加入Na2ATP起始反應(yīng)。在37℃下繼續(xù)溫育10 min后，加入300 μL 0.1 mol·L－1HCl終止反應(yīng)，隨即將反應(yīng)混合液在冰浴中冷卻，將冷卻后的反應(yīng)混合液在室溫下以5 000 r·min－1離心10 min，留上清液。然后加入2.1 mL著色劑溶液（300 μL 2.5 mol·L－1H2SO4；300 mol·L－1l 2.5%（W/V）鉬酸銨；300 μL 3%（W/V）NaHSO3和1%（W/V）p－甲基氨基苯酚硫酸鹽；1.2 mL去離子水），混合后在37℃下溫育30 min，隨后立即測(cè)定OD660nm，將反應(yīng)混合液中的酶粗提取物替換為 100 μL的50 mmol·L－1Tris－HCl緩沖液（pH 7.0）作為空白。用標(biāo)準(zhǔn)曲線查得或用回歸方程式求得試樣分解液的含磷量。細(xì)胞膜粗提取物中蛋白質(zhì)的定量采用碧云天的BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒，按照試劑盒的說明書進(jìn)行操作。H+－ATPase酶的活性用U·mg－1蛋白質(zhì)來表示，其中每個(gè)活力單位定義為1 mg H+－ATPase粗提取物在1 min內(nèi)分解ATP形成1 μmol的無機(jī)磷酸鹽[3]。

2 結(jié)果與分析

2.1 H+-ATPase缺陷突變菌株的篩選

在本試驗(yàn)中，利用新霉素來篩選質(zhì)膜H+－ATPase缺陷的德氏乳桿菌保加利亞亞種突變菌株。在挑取了200個(gè)菌落后，篩選得到1株H+－ATPase缺陷的德氏乳桿菌保加利亞亞種突變菌株。命名為KLDS1.9201－11，它的OD600nm和pH分別為0.7647和4.60。新霉素的攝入是一個(gè)耗能的過程[7]，質(zhì)膜H+－ATPase活力高的細(xì)菌能夠產(chǎn)生足夠的能量來攝入新霉素，從而新霉素就可以與30S核糖體亞基結(jié)合，抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，也就抑制了細(xì)菌在平板上的生長(zhǎng)。而質(zhì)膜H+－ATPase活力差的細(xì)菌不能產(chǎn)生足夠的能量來攝入新霉素，即具有新霉素抗性，因此可以在含有新霉素的MRS平板上生長(zhǎng)。

2.2 親本菌株與突變菌株的生長(zhǎng)曲線

將親本菌株KLDS1.9201與突變菌株KLDS 1.9201－11接種于MRS液體培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)，每隔2 h測(cè)定發(fā)酵液OD600nm和pH，直至24 h為止，結(jié)果如圖1、2所示。

由圖1可知，在培養(yǎng)24 h后，KLDS1.9201和KLDS1.9201－11的吸光度OD600nm分別為1.0299和0.7024，突變菌株KLDS1.9201－11的細(xì)胞密度明顯降低。由圖2可知，在培養(yǎng)24 h后，KLDS1.9201和KLDS1.9201－11的pH分別為4.05和4.56，突變菌株KLDS1.9201－11的產(chǎn)酸量較親本菌株KLDS 1.9201也明顯降低。質(zhì)膜H+－ATPase缺陷的德氏乳桿菌保加利亞亞種突變菌株具有較低的底物磷酸化水平[3]，因此ATP的產(chǎn)量也隨之減少，導(dǎo)致了突變菌株KLDS1.9201－11的低生長(zhǎng)速率和弱產(chǎn)酸能力。

圖1 KLDS 1.9201和KLDS 1.9201-11的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of KLDS 1.9201 and KLDS 1.9201-11

圖2 KLDS 1.9201和KLDS 1.9201-11的pH變化曲線Fig.2 pH curve of KLDS 1.9201 and KLDS 1.9201-11

2.3 酸應(yīng)激對(duì)菌株的生長(zhǎng)及H+-ATPase活性的影響

2.3.1 酸應(yīng)激對(duì)菌株的生長(zhǎng)影響

親本菌株KLDS1.9201和突變菌株KLDS1.9201－11在酸應(yīng)激前后的活菌數(shù)變化情況見表1。

由表1可知，親本菌株KLDS1.9201和突變菌株KLDS1.9201－11在pH 3.0的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 h后，活菌數(shù)與在普通MRS液體培養(yǎng)基中時(shí)明顯下降。親本菌株KLDS1.9201下降了86.98%，突變菌株KLDS1.9201－11下降了99.98%，顯而易見，突變菌株比親本菌株活菌數(shù)下降明顯。

在pH 3.0的MRS液體培養(yǎng)基中，突變菌株比親本菌株表現(xiàn)出更強(qiáng)的酸敏感性。在酸性環(huán)境下，乳酸菌通過質(zhì)膜H+－ATPase將胞內(nèi)質(zhì)子泵出胞外來提高胞內(nèi)pH，保持胞內(nèi)pH維持在中性附近，使得菌體自身的代謝正常進(jìn)行，而突變菌株的質(zhì)膜H+－ATPase活力較差，不能及時(shí)有效的將胞內(nèi)質(zhì)子泵出胞外，致使胞內(nèi)pH過低，影響菌體的生長(zhǎng)，因此親本菌株的酸耐受力比突變菌株強(qiáng)。

表1 酸應(yīng)激對(duì)菌株活力的影響Table 1 Effects of acid stress on the strains activity

2.3.2 酸應(yīng)激對(duì)H+－ATPase活性的影響

采用碧云天的BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒測(cè)得的牛血清白蛋白（BSA）蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。

圖3 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Protein standard curve

由圖3可知，蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.9942，說明本標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性程度較高，可作為蛋白質(zhì)濃度測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于H+－ATPase活性測(cè)定過程中蛋白含量的測(cè)定。準(zhǔn)確吸取0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mL磷標(biāo)準(zhǔn)溶液于100 mL容量瓶中，用超純水定容。隨后按照1.2.6的方法制作磷標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖4。在無機(jī)磷酸鹽濃度為0～0.27 mmol·L－1的范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)為0.9982，說明本標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性程度較高，可作為無機(jī)磷酸鹽濃度測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于H+－ATPase活性測(cè)定過程中無機(jī)磷酸鹽含量的定量。

親本和突變菌株酸應(yīng)激前后的酶活變化結(jié)果見表2。由表2可知，突變菌株的質(zhì)膜H+－ATPase活性明顯比親本菌株低，而且在3 h的pH 3.0的酸應(yīng)激后，酶活都有了明顯下降，親本菌株KLDS1.9201下降了13.33%，突變菌株KLDS 1.9201－11下降了21.15%，說明突變菌株具有更強(qiáng)的酸敏感性。

圖4 磷濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Protein standard curve

表2 酸應(yīng)激對(duì)H+-ATPase酶活的影響Table 2 Effects of acid stress on the H+-ATPase activity

在酸奶的后酸化過程中，當(dāng)pH下降時(shí)，質(zhì)膜H+－ATPase弱化的突變菌株比親本菌株表現(xiàn)出較弱的代謝水平，使產(chǎn)酸水平下降[8]，從而使酸奶的后酸化速率降低，這對(duì)弱后酸化酸奶發(fā)酵劑的開發(fā)具有重要意義。

2.4 冷應(yīng)激對(duì)菌株的生長(zhǎng)及H+-ATPase活性的影響

2.4.1 凍干對(duì)菌株的生長(zhǎng)影響

親本菌株KLDS1.9201和突變菌株KLDS 1.9201－11在凍干前后的活菌數(shù)變化情況見表3。

凍干是菌種保存的重要手段，可以使菌種的活力得到保證[9]。通過本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，親本菌株在凍干后活菌數(shù)下降了76.71%，而突變菌株只下降了4.88%。在凍干過程中，細(xì)菌活性的下降可能主要由以下兩個(gè)因素引起，一是在預(yù)凍時(shí)，由于細(xì)胞內(nèi)的水分形成冰晶造成細(xì)胞膜損傷而導(dǎo)致部分細(xì)胞死亡[10]；二是在凍干過程中，部分細(xì)菌可能會(huì)由于嚴(yán)重缺水引起蛋白質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)代謝相關(guān)酶類的變性而死亡[11]。不同屬的細(xì)菌對(duì)凍干的抵抗力不同，同一屬的不同菌種，同種的不同菌株也會(huì)表現(xiàn)出對(duì)凍干的不同抗性[12]，由此可以得出結(jié)論，突變菌株的冷適應(yīng)性比親本菌株強(qiáng)。

表3 冷應(yīng)激對(duì)菌株活力的影響Table 3 Effects of cold stress on the strains activity

2.4.2 凍干對(duì)H+－ATPase活性的影響

親本和突變菌株凍干前后的H+－ATPase酶活見表4。

表4 凍干對(duì)質(zhì)膜H+-ATPase酶活的影響Table 4 Effects of cold stress on the H+-ATPase activity

親本菌株凍干后的酶活力下降了4.27%，由凍干前后親本和突變菌株的活菌數(shù)變化可知，凍干對(duì)菌體是有損傷的，其中對(duì)親本菌株的損傷較大，凍干后活菌數(shù)下降了76.71%，所以有可能導(dǎo)致其H+－ATPase酶被破壞，從而導(dǎo)致其活力的降低。然而突變菌株的H+－ATPase酶活卻上升了29.71%，這可能是由于凍干對(duì)突變菌株的傷害作用并不大，突變菌株的活菌數(shù)在凍干后僅下降了4.88%就是證明。另外，突變菌株H+－ATPase酶活的增加可能是由于冷應(yīng)激導(dǎo)致其大量表達(dá)，仍需進(jìn)一步研究。

3 討論與結(jié)論

本研究篩選出一株質(zhì)膜H+－ATPase缺陷的德氏乳桿菌保加利亞亞種自發(fā)突變株，命名為KLDS1.9201－11，以3%接種量，37℃培養(yǎng)24 h后，與親本菌株KLDS1.9201相比其生長(zhǎng)速率較慢，且產(chǎn)酸能力差。在經(jīng)過pH 3.0的酸應(yīng)激3 h后，親本菌株和突變菌株的活菌數(shù)分別減少了86.98%和99.98%，H+－ATPase活性分別降低了13.33%和21.15%，突變菌株表現(xiàn)出更強(qiáng)的酸敏感性，這有利于弱后酸化酸奶發(fā)酵劑的制作。在凍干后，親本菌株和突變菌株的活菌數(shù)分別減少了76.71%和4.88%，親本菌株的H+－ATPase活性降低了4.27%，突變菌株的H+－ATPase活性上升了29.71%，說明突變菌株的冷適應(yīng)性比親本菌株好，有利于直投式發(fā)酵劑的制作過程中活菌數(shù)的提高。因此，質(zhì)膜H+－ATPase缺陷的德氏乳桿菌保加利亞亞種自發(fā)突變菌株KLDS1.9201－11能夠使酸奶的后酸化速率降低，酸奶的保質(zhì)期能夠延長(zhǎng)，可用于弱后酸化直投式酸奶發(fā)酵劑的研制。

[1]李瑩,周劍忠,黃開紅.弱后酸化酸奶發(fā)酵劑及高品質(zhì)酸奶研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2009(4):294－296.

[2]徐成勇,吳昊,鄭思聰,等.酸乳后酸化影響因子的初步研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2006,32(12):10－14.

[3]劉飛,杜鵬,王玉堂,等.保加利亞乳桿菌H+－ATPase缺陷型菌株的篩選[J].微生物學(xué)報(bào),2009,49(1):38－43.

[4]Mitsuharu M,Hifumi O,Yoshimi B.H+－ATPase activity in Bifidobacterium with special reference to acid tolerance[J].International Journal of Food Microbiology,2004,93(1):109－113.

[5]Belli W A,Marquis R E.Adaptation of streptococcus mutans and enterococcus hirae to acid stress in continuous culture[J].Applied and Environmental Microbiology,1991,51(4):1134－1138.

[6]Ongol M P,Sawatari Y,Ebina Y,et al.Yoghurt fermented by Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus H+－ATPase－Fefective mutants exhibits enhanced viability of Bifidobacterium breve during storage[J].International Journal of Microbiology,2007,116:358－366.

[7]Kanner B I,Gutnick D L.Use of neomycin in the isolation of mutants blocked energy conservation in Escherichia coli[J].Journal of Bacteriology,1972,111:287－289.

[8]龐啟亮,霍貴成.保加利亞乳桿菌H+－ATPase缺陷型菌株延緩后酸化及發(fā)酵性質(zhì)的研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2011,42(2):5－9.

[9]付良,劉飛,霍貴成.一株能夠利用血紅素進(jìn)行有氧呼吸的乳酸乳球菌[J].微生物學(xué)報(bào),2008,48(9):1256－1259.

[10]陳聲明,呂琴.微生物冷凍干燥的抗性機(jī)理[J].微生物學(xué)通報(bào),1996(4):236－238.

[11]萬紅兵,田洪濤,種克.冷凍和凍干過程對(duì)保加利亞乳桿菌存活性影響的研究[J].現(xiàn)代食品科技,2006,22(4):1－3.

[12]張英華,霍貴成,郭鸰.乳酸菌冷凍干燥技術(shù)研究進(jìn)展[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2005,36(6):799－803.