胡明明，劉子臣，張紅梅，魯葆華，李杰，王群慧，胡范彬，林海峰，李寶蘭，張同梅

0 引言

據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)發(fā)布的2018年GLOBOCAN報告，大約有21萬新發(fā)肺癌病例和180萬肺癌死亡病例[1]。在中國，肺癌是最常見的癌癥，并且是癌癥相關(guān)死亡的主要原因[2-3]。肺癌患者在診斷時，中位年齡約在60歲左右，45歲以下患者在高加索人群中占比不到2%，在中國約5%[4]。隨著肺癌發(fā)病率上升，發(fā)病年齡也呈年輕化趨勢。

目前研究發(fā)現(xiàn)，青年肺癌患者中女性、腺癌、不吸煙、晚期患者比例較高[5-6]。關(guān)于青年肺癌的年齡界限，目前沒有一致的標(biāo)準(zhǔn)，既往研究中曾使用50、45、35歲等不同的劃分標(biāo)準(zhǔn)，但多數(shù)以40歲為界限，因此本研究中選擇40歲為劃分標(biāo)準(zhǔn)。有研究發(fā)現(xiàn)，青年肺癌患者除了獨特的臨床病理特征以外，在基因圖譜方面也不同于老年肺癌患者，有更多驅(qū)動基因的改變[7]。近年來，程序性死亡蛋白1（programmed cell death 1,PD-1）/程序性死亡蛋白配體1（programmed cell death-ligand 1,PD-L1）抑制劑在肺癌治療中顯示出良好的療效，腫瘤細(xì)胞的PD-L1表達(dá)可以預(yù)測免疫治療的療效，目前尚未見青年肺癌PD-L1表達(dá)的相關(guān)數(shù)據(jù)。因此本研究以青年肺癌患者為研究對象，針對該人群EGFR突變狀態(tài)、突變亞型分布和腫瘤細(xì)胞PD-L1的表達(dá)展開。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2014年1月—2019年12月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院住院并經(jīng)根治性手術(shù)切除、病理確診為NSCLC的臨床資料，包括性別、年齡、吸煙史、病理類型（包括病理亞型）、病理分期等，共納入年齡≤40的青年肺癌患者47例，≥60歲老年肺癌患者共1 878例。術(shù)后分期根據(jù)第8版美國癌癥聯(lián)合會（American Joint Commitfee on Cancer,AJCC）TNΜ分期系統(tǒng)進(jìn)行分期。病理類型根據(jù)2015年世界衛(wèi)生組織肺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類。納入標(biāo)準(zhǔn)如下：（1）病理診斷為NSCLC患者；（2）經(jīng)影像學(xué)診斷為可手術(shù)的NSCLC患者；（3）首次施行根治性手術(shù)切除，術(shù)后切緣陰性。排除標(biāo)準(zhǔn)如下：（1）含小細(xì)胞肺癌成分的NSCLC；（2）有5年內(nèi)第二原發(fā)性腫瘤的病史；（3）患者在手術(shù)前接受過新輔助治療，包括化療、免疫治療和靶向治療。本研究經(jīng)北京胸科醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 EGFR突變狀態(tài)的檢測 使用EGFR突變檢測試劑盒（艾德生物科技有限公司，廈門，中國），檢測位點包括外顯子18-21的點突變（G719A、G719S、G719C、T790Μ、L858R、L861Q和S768I），三種外顯子20的插入突變（20ins）和19種外顯子的缺失突變（19del）。

1.2.2 免疫組織化學(xué)檢測PD-L1的表達(dá) 手術(shù)切除標(biāo)本用10%甲醛固定并進(jìn)行石蠟包埋、切片、抗原修復(fù)、封閉后，滴加PD-L1抗體（22C3抗體，Dako公司，美國），于4℃冰箱中過夜，經(jīng)二抗孵育、DAB顯色、蘇木精對比染色，分化、脫水、透明封片。PD-L1判讀標(biāo)準(zhǔn)：PD-L1表達(dá)腫瘤比例評分（tumor proportion score,TPS）為任意強(qiáng)度下部分或完全膜染色腫瘤細(xì)胞的百分比，TPS＜1%為陰性，≥1%為陽性[8]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

傾向性評分法由3.5.2版本的R語言軟件完成，采用“ΜatchIt”R包的最近鄰匹配法對青年組和老年組進(jìn)行1:2匹配，匹配因素包括性別、病理類型、吸煙狀態(tài)，最終成功匹配老年組肺癌患者94例。數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件包處理，年齡、PD-L1表達(dá)以中位數(shù)和四分位間距表示（Μ，Q1-Q3）。分類變量的比較采用卡方檢驗或Fisher精確檢驗，兩樣本之間連續(xù)變量的比較使用Μann-Whitney檢驗。P＜0.05（雙邊檢驗）為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者的基線臨床病理特征

2014年1月—2019年12月收治的可手術(shù)的青年NSCLC患者共47例，隨機(jī)匹配的94例老年患者的中位年齡66歲（63～69歲），詳細(xì)臨床病理資料見表1。將Ⅰ+Ⅱ期對比Ⅲ+Ⅳ期，可以看到，即使兩組都是術(shù)前評估為可手術(shù)的NSCLC患者，青年肺癌組手術(shù)患者分期更晚（P=0.027），見表1。

表1 青年和老年NSCLC患者的臨床病理特征Table 1 Baseline characteristics of young and elder NSCLC patients

2.2 青年肺癌和老年肺癌手術(shù)標(biāo)本中EGFR突變情況

47例青年肺癌手術(shù)標(biāo)本中有21例檢測到EGFR突變（21/47,44.7%），其中12例為19del，3例為20ins，4例為L858R，1例為T790Μ，1例為L861Q。94例老年肺癌手術(shù)標(biāo)本中，40例患者檢測到EGFR突變（40/94,42.6%），其中，18例為19del，1例為20ins，18例為L858R，2例為G719X/S768I復(fù)合突變，1例為S768I。經(jīng)卡方檢驗，青年和老年肺癌兩組在EGFR突變率上無明顯差異（P=0.545）。在EGFR突變類型的構(gòu)成比方面，青年肺癌組中19del和20ins所占的比例較老年組高，分別為57.1%（12/21）vs.45.0%（18/40）和14.3%（3/21）vs.2.5%（1/40）；在老年肺癌組中，L858R比例較青年肺癌組高，為45.0%（18/40）vs.19.1%（4/21），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.045），見圖1。

2.3 腫瘤組織中PD-L1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

141例手術(shù)切除標(biāo)本中，有136例檢測了PD-L1蛋白的表達(dá)，57例（41.9%）表達(dá)陽性，其中18例（13.2%）高表達(dá)（PD-L1≥50%）。PD-L1陽性表達(dá)率與年齡、性別、吸煙史、病理類型、EGFR突變無關(guān)（P＞0.05），但與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑相關(guān)，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性病例中PD-L1陽性率更高（P＜0.001）；瘤體直徑越大，PD-L1陽性率越高（P=0.013），見表2。在5種腺癌組織學(xué)亞型（腺泡狀為主型腺癌、乳頭狀為主型腺癌、微乳頭狀為主型腺癌、貼壁狀為主型腺癌以及實體為主型腺癌）中比較PD-L1的表達(dá)率，發(fā)現(xiàn)實體為主亞型中PD-L1陽性率明顯高于其他亞型（P=0.006），見表3。分析EGFR 19del和21L8585R與PD-L1陽性表達(dá)率之間的關(guān)系，結(jié)果顯示在青年肺癌組中，19del組PD-L1表達(dá)為5%（0～20%），L858R組表達(dá)為0，二者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.047）；而在老年肺癌組中，19del組與L88R組PD-L1表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.602）。

表2 青年和老年NSCLC患者PD-L1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系Table 2 Association between PD-L1 expression and clinicopathological characteristics in young and elder groups

表3 青年和老年肺腺癌患者PD-L1表達(dá)和組織學(xué)亞型的關(guān)系Table 3 Association between PD-L1 expression and histological subtype in lung adenocarcinoma in young and elder groups

3 討論

近年來青年肺癌以其獨特的臨床病理特征引起了研究者的注意。本研究納入了47例行手術(shù)切除的年齡≤40歲的青年肺癌病例，臨床特征顯示女性、不吸煙、腺癌為主要特點。我們對47例手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行了EGFR基因檢測和PD-L1表達(dá)的研究。結(jié)果顯示，青年肺癌中EGFR突變頻率為44.7%（21/47），60歲及以上患者RGFR突變率為42.6%（40/94），兩個隊列中EGFR突變率無明顯差異。Yang等團(tuán)隊對640例肺癌組織進(jìn)行EGFR、KRAS、ALK、ROS1基因檢測發(fā)現(xiàn)，不同年齡組間ALK、ROS1及RET等融合基因的發(fā)生率差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但EGFR、KRAS等基因突變的發(fā)生率差異無統(tǒng)計學(xué)意義[9]。Hu等對2 544例中國肺癌標(biāo)本進(jìn)行了EGFR的基因檢測，也發(fā)現(xiàn)不同年齡組的患者EGFR突變率沒有明顯差異[10]，但是基于SEER數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)顯示青年肺癌患者的EGFR突變率明顯低于老年患者，種族差異或許是結(jié)果不一致的原因之一。

EGFR突變包括多種形式，主要發(fā)生于胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)域的18-21外顯子，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有30多種的突變形式。EGFR 19del和21L858R是兩種最常見、且與臨床療效最為相關(guān)的敏感突變，約占所有突變形式的80%～90%。第三類最常見的突變形式是20ins，其他突變形式較為少見，包括G719A、G719S、G719C、T790Μ、L858R、L861Q和S768I[11-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，在EGFR各突變形式中，L858R在老年隊列中占比更高，19del和20ins在青年隊列中占比更高，這與近年來的相關(guān)研究報道一致[7,10]。目前為止，尚沒有研究解釋19del和L858R突變發(fā)生率在人口學(xué)方面有差異的原因，尚需后續(xù)研究進(jìn)行相關(guān)的探索。研究表明，19del的患者從靶向治療中獲益要多于L858患者，或許可以部分歸因于19del的患者在年齡上的優(yōu)勢[14-15]。EGFR 20ins的發(fā)生率占所有NSCLC病例的0.1%～4%，占EGFR突變患者的1～12%[16]，本研究中老年組20ins占EGFR突變患者的2.5%，青年組中占比為14.3%，提示青年肺癌隊列相較老年隊列而言，雖然EGFR突變率上沒有差異，但是突變形式上有不同于老年患者的特征。

近幾年來，以PD-1/PD-L1抑制劑為代表的免疫治療，極大地改變了腫瘤治療格局，目前認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞PD-L1的表達(dá)率可以預(yù)測免疫治療的效果。目前尚未有研究關(guān)注青年肺癌腫瘤免疫微環(huán)境方面的特點。本研究通過分析136例手術(shù)切除的癌組織標(biāo)本中PD-L1表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PD-L1的陽性表達(dá)率與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，腫瘤直徑越大，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性者，PD-L1陽性率越高。Lee等、Zhao等研究發(fā)現(xiàn)PD-L1的表達(dá)與腫瘤大小、腦轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[17-18]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細(xì)胞通過表達(dá)PD-L1有助于免疫逃逸；外泌體表達(dá)的PD-L1可以抑制CD4+和CD8+等免疫效應(yīng)細(xì)胞的活化，誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞凋亡，從而參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[19]。本研究未發(fā)現(xiàn)PD-L1表達(dá)率與年齡相關(guān)，但是腫瘤免疫微環(huán)境非常復(fù)雜，除了PD-L1，還有CD8+T淋巴細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，還需繼續(xù)探索青年肺癌在腫瘤免疫微環(huán)境方面的特點。腺癌的病理亞型，包括實體型、乳頭型、微乳頭型、腺泡型、貼壁型等，在所有亞型中，實體亞型和微乳頭亞型與可手術(shù)NSCLC患者的預(yù)后較差有關(guān)，提示不同亞型的肺癌其惡性程度是不同的[20]。本研究針對手術(shù)標(biāo)本，分析了腺癌不同病理亞型和PD-L1表達(dá)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在實體亞型中，PD-L1陽性率明顯增高，這與既往研究結(jié)果一致[21-23]。

本研究進(jìn)一步分析了EGFR 19del和L858R這兩種最主要的突變形式中PD-L1的表達(dá)差異。在老年組中，未觀察到兩種突變形式之間存在差異，但是在青年組中，19del患者PD-L1陽性率明顯高于L858R患者，前者腫瘤細(xì)胞PD-L1表達(dá)中位數(shù)為5%（0～20%），而L858R組中4例患者PD-L1表達(dá)均為陰性，這是首次在青年肺癌中關(guān)注EGFR不同突變形式PD-L1表達(dá)的差異。目前相關(guān)研究主要集中于老年人群，因為肺癌的高發(fā)年齡為60歲以后，且研究結(jié)果也不一致，Jain等和Chen等發(fā)現(xiàn)L858R中PD-L1表達(dá)高于19del[22,24]，Song等發(fā)現(xiàn)19del中PD-L1表達(dá)高于L858R[25]，也有研究者發(fā)現(xiàn)兩種突變形式之間不存在差異[26]。

本研究也存在一定的局限性，首先本研究為回顧性研究，納入病例數(shù)量較少，其次納入研究的患者缺乏生存隨訪數(shù)據(jù)，無法對后續(xù)青年NSCLC的整體預(yù)后、EGFR-TKI靶向治療的療效、不同EGFR突變類型患者后續(xù)免疫治療的療效進(jìn)行后續(xù)分析，尚需繼續(xù)開展相關(guān)研究來關(guān)注這一人群。