顏 玲，黃德彬，劉錦紅，周慶華

(1湖北民族學院醫(yī)學院，湖北恩施 445000;2.荊楚理工學院醫(yī)學院，湖北荊州 434000)

缺血性腦血管病因持續(xù)缺血缺氧，可引起缺血性損傷和再灌注損傷。表現(xiàn)為能量代謝障礙、細胞內(nèi)Ca2+超載及細胞凋亡等一系列病理過程，導致腦細胞不可逆性壞死與凋亡［1］。目前對其治療主要是通過促進供血、保護腦組織和加速腦組織重建。但這些仍未有充分證據(jù)證實其有效性。黃芪多糖(AP)有調(diào)節(jié)免疫和延緩衰老等作用［2］。我們曾發(fā)現(xiàn)AP能調(diào)控海馬部分神經(jīng)遞質(zhì)和c-fos mRNA表達［1］，本實驗發(fā)現(xiàn)AP能顯著減少腦缺血/再灌注大鼠腦皮質(zhì)細胞凋亡。

1 材料與方法

1.1 材料 ♂Wister大鼠120只(180～220 g，重慶醫(yī)科大學實驗動物中心，4110302)。Pharmacia Gene QuantⅡ型RNA/DNA檢測儀(美國Pharmacia Gene Quant Pro)，TP600型PCR基因擴增儀(日本TaKaRa)，黃芪多糖(AP，Sigma Aldrich公司);RNA酶A(RNAseA，Sigma)、c-fos抗體和Bcl-2抗體(博士德生物工程有限公司)、PV6001二步法檢測試劑盒和DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋)、TRIzol Reagent和引物核苷酸片段(Invitrogen公司)、RNA PCR Kit(TOYOBO)等(EB，AMRESCO公司)。

1.2 動物處理與神經(jīng)功能分級［3］動物麻醉后，右股動脈插管采血備用，頸正中縱切口，暴露右頸總動脈、頸外動脈及頸內(nèi)動脈。取90只大鼠，用Longa和Nagasawa線栓法［4］作為右大腦中動脈阻塞模型(RMCAO)，另30只大鼠作為假手術(shù)組(SOG，未阻塞大腦中動脈)。分別于1、3、7 d最后一次注射藥物后，后退栓塞線再灌注。神經(jīng)功能缺陷評分后斷頭取血［3］。

1.3 動物分組及治療 從RMCAO中篩選出合格大鼠72只，隨機分成3個模型組(MG-1 d，3 d，7 d，n=8)、3個低劑量AP治療組(L-APTG-1 d，3 d，7 d，n=8)和3個高劑量AP治療組(H-APTG-1 d，3 d，7 d，n=8);按神經(jīng)功能分級，從SOG中篩選出1-3分合格大鼠27只，隨機分成3個假手術(shù)組(SOG-1 d，3 d，7 d，n=9)。L-APTG和H-APTG鼠術(shù)后分別ip AP 5 mg·kg－1和15 mg·kg－1(每日2次，以NS稀釋成1 ml)，直至處死取材。SOG和MG術(shù)后每日2次注射等容量NS(ip)。

1.4 組織學與電鏡觀察 術(shù)后1、3和7 d，最后一次注射藥物后斷頭取血取腦，剝離大腦皮層額葉、頂葉、枕葉以及視交叉。從前至后冠狀切片3張，固定、石蠟包埋、HE染色。另取相應腦皮質(zhì)戊二醛固定、PBS漂洗以及丙酮和乙醇梯度脫水，包埋、切片、染色。

1.5 腦皮質(zhì)c-fos蛋白和Bcl-2 mRNA表達的測定

1.5.1 Western blot法檢測細胞內(nèi)c-fos與Bcl-2表達 用蛋白定量測定(BCA法)。經(jīng)逐步處理，分別加入Ⅰ抗和Ⅱ抗孵育，清洗、發(fā)光顯色、X射線底片曝光。內(nèi)參照為β-actin。以Quantity One軟件分析蛋白條帶平均吸光度。

1.5.2 腦皮質(zhì)總RNA提取與Bcl-2基因擴增 取勻漿處理得DNA溶液后，紫外分光光度計測定RNA的OD值。按試劑盒說明配制反轉(zhuǎn)錄和PCR反應體系，移入PCR儀變性30個循環(huán)。β-actin為內(nèi)參照，引物序列為:Bcl-2上游5'-CTTCCAGCCTGAGAGCAACC-3'，下游 5'-CATCCCAGCCTCCGTTATCC-3'，擴增片段411bp;β-actin上游5'-ATCTGGCACCACACCTTC-3'，下游5'-AGCCAGGTCCAGACGCA-3'，擴增片段639bp。凝膠成像系統(tǒng)分析。

2 結(jié)果

2.1 AP對MCAO大鼠神經(jīng)功能缺損的影響 在1、3和7 d，H-APTG神經(jīng)功能缺損評分明顯低于其他各組(P＜0.05或P＜0.01);在3 d和7 d，L-APTG神經(jīng)功能缺損評分明顯低于MG(P＜0.05)。見Tab 1。

Tab 1 Effects of Astragalus Polysaccharide onneurological score after middle cerebral artery occlusion in cerebral cortex of rats(±s)

Tab 1 Effects of Astragalus Polysaccharide onneurological score after middle cerebral artery occlusion in cerebral cortex of rats(±s)

*P＜0.05 vs MG and SOG;△P＜0.05 vs L-APTG

Group n Postoperative 30 min 1 d 3 d 7 d SOG90 0 0 0 MG 8 2.53±0.52 2.48±0.36 2.36±0.54 1.97.±0.18 L-APTG 8 2.68±0.68 2.29±0.53 2.07±0.61* 1.46±0.24* H-APTG 8 2.57±0.49 2.12±0.39* 1.62±0.43＊△ 1.03±0.17＊△

2.2 AP對MCAO大鼠大腦皮質(zhì)病理學變化的影響

2.2.1 HE染色觀察結(jié)果 在術(shù)后3 d和7 d，MG大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)纖維有大量空泡，部分變性壞死的神經(jīng)細胞被吸收，很多細胞著色變淺，排列紊亂，部分細胞膜與周圍融合，多數(shù)細胞核固縮，核仁幾乎全部消失，梗死灶的外周可見大量凋亡的細胞和皺縮的細胞漿，細胞核明顯的固縮集邊;HAPTG大鼠大腦皮質(zhì)病理改變明顯減輕，神經(jīng)纖維內(nèi)罕見空泡，明顯少于MG和L-APTG，其散亂、著色、水腫細胞明顯少于MG和L-APTG。

2.2.2 AP對MCAO腦皮質(zhì)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的影響 在7 d，MG腦皮質(zhì)細胞漿內(nèi)可見大量空泡;細胞核皺縮成馬蹄形或分葉狀，染色質(zhì)凝聚成各種形態(tài)，染色加深;細胞內(nèi)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)模糊或缺失;線粒體氣球樣腫脹，嵴減少甚至缺失;粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)幾乎消失，質(zhì)膜結(jié)構(gòu)模糊不清或不連續(xù);H-APTG細胞膜較清晰，細胞漿內(nèi)未見空泡;細胞器膜和核膜完整;少數(shù)細胞核皺縮，罕見染色質(zhì)凝聚。

2.3 AP對MCAO大鼠腦皮質(zhì)細胞凋亡率的影響 各個時間點的細胞凋亡率SOG明顯低于其他各組(P＜0.05);在1 d，MG與L-APTG相當(P＞0.05)，而H-APTG明顯低于MG(P＜0.05);在3 d和7 d，L-APTG明顯低于MG(P＜0.05)，而H-APTG又明顯低于L-APTG和MG(P＜0.05)。見Tab 2。

Tab 2 Effects of Astragalus Polysaccharide on apoptotic ratio after middle cerebral artery occlusion in cerebral cortex of rats(±s)

Tab 2 Effects of Astragalus Polysaccharide on apoptotic ratio after middle cerebral artery occlusion in cerebral cortex of rats(±s)

*P＜0.05 vs SOG;△P＜0.05 vs L-APTG;▲P＜0.05 vs MG.

Group n 1 d 3 d 7 d SOG 9 1.78±0.03 1.96±0.06 1.84±0.08 MG 8 9.73±0.49* 8.83±0.63* 8.18±0.71* L-APTG 8 8.97±0.67* 6.56±0.33＊▲ 5.08±0.45＊▲H-APTG 8 7.84±0.35＊▲ 5.01±0.51＊△▲ 2.64±0.63＊△▲

2.4 AP對MCAO大鼠腦皮質(zhì)c-fos蛋白表達的影響 結(jié)果顯示，在各個時間點，SOG的c-fos蛋白表達無變化。SOG明顯低于其他各組(P＜0.05);在1 d和3 d，L-APTG明顯低于MG，而H-APTG又明顯低于L-APTG(P＜0.05);在7 d，H-APTG明顯高于其他各組(P＜0.05)，L-APTG與MG相當(P＞0.05)。見Tab 3。

Tab 3 Effects of Astragalus Polysaccharide on expression of c-fos protein after middle cerebral artery occlusion in cerebral cortex of rats(±s)

Tab 3 Effects of Astragalus Polysaccharide on expression of c-fos protein after middle cerebral artery occlusion in cerebral cortex of rats(±s)

*P＜0.05 vs SOG;△P＜0.05 vs L-APTG;▲P＜0.05 vs MG.

Group n 1 d 3 d 7 d SOG 9 1.46±0.17 1.39±0.14 1.61±0.16 MG 8 8.06±1.13* 7.11±1.78* 2.73±0.73* L-APTG 8 6.62±1.49* 5.83±1.67＊▲ 3.21±1.04* H-APTG 8 5.07±2.43＊△▲ 4.12±1.34＊△▲ 5.77±1.12＊△▲

2.5 AP對MCAO大鼠腦皮質(zhì)細胞Bcl-2蛋白與mRNA表達的影響 在各時間點，SOG無明顯變化，明顯低于其他各組(P＜0.05);在各時間點，MG明顯高于SOG，在第3 d達峰值，第7 d呈現(xiàn)下降趨勢;在各時間點，L-APTG保持相對平穩(wěn)水平，但在7 d因 MG下降而明顯高于 MG(P＜0.05);在各時間點，H-APTG隨時間推移呈持續(xù)升高，在7 d仍呈現(xiàn)增高趨勢，明顯高于其他各組(P＜0.05)。見Tab 4。

Tab 4 Effects of Astragalus Polysaccharide on expression of Bcl-2 mRNA after middle cerebral artery occlusion in cerebral cortex of rats(±s)

Tab 4 Effects of Astragalus Polysaccharide on expression of Bcl-2 mRNA after middle cerebral artery occlusion in cerebral cortex of rats(±s)

*P＜0.05 vs SOG;△P＜0.05 vs L-APTG;▲P＜0.05 vs MG.

Group n 1 d 3 d 7 d SOG 9 0.2173±0.0312 0.2749±0.0407 0.2354±0.0316 MG 8 0.3537±0.0537* 0.4012±0.0328* 0.3376±0.0429* L-APTG 8 0.2953±0.0418* 0.3513±0.0361* 0.3841±0.0377* H-APTG 8 0.3762±0.0344* 0.4936±0.0432＊△ 0.6982±0.0419＊△▲

3 討論

腦缺血使得腦能量代謝障礙，大量Na+、Ca2+積聚于神經(jīng)元內(nèi)，引起神經(jīng)元水腫，甚至破裂［5］。其修復與再生過程伴隨相關(guān)蛋白與基因表達(c-fos、Bcl-2等)，這些表達調(diào)控神經(jīng)元的修復與再生［6］。本研究發(fā)現(xiàn)，AP緩解神經(jīng)功能損傷癥狀，降低神經(jīng)元凋亡率。其作用機制可能是:

3.1 調(diào)控大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞c-fos表達，促進神經(jīng)元修復與再生 c-fos mRNA在一定范圍內(nèi)的表達，對神經(jīng)細胞損傷的修復有雙向調(diào)控作用［4］。c-fos早期在腦中參與神經(jīng)元信號的整合、轉(zhuǎn)導、分析與凋亡，與神經(jīng)功能、學習記憶相關(guān)［5］，其表達，可能直接參與了神經(jīng)元的分化、生長及神經(jīng)突觸的可塑性變化等過程［6］。神經(jīng)元c-fos適度表達，能促進損傷神經(jīng)元的再生，若過度表達，則加重神經(jīng)元的損傷并阻止其修復與再生［5］。本研究發(fā)現(xiàn)，高劑量AP治療組大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元c-fos的表達明顯低于低劑量AP治療組和模型組(P＜0.05)，但在7 d高于其他各組(P＜0.05)。表明AP早期抑制c-fos高表達，后期維持低水平表達，有利于損傷神經(jīng)元的修復與再生。

3.2 增強Bcl-2蛋白與mRNA表達，阻止神經(jīng)細胞凋亡Bcl基因家族包括抗細胞凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-xL等)和促細胞凋亡蛋白(Bax、Bak等)兩類相反功能同源蛋白，其相互作用調(diào)節(jié)著細胞的存活與凋亡［3］。Bcl-2結(jié)合Bax形成的異源二聚體可阻止神經(jīng)細胞凋亡［2］。因此，Bcl-2蛋白與mRNA表達直接決定著神經(jīng)細胞的存活與凋亡取向［4］。本研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后，高劑量AP治療組，Bcl-2蛋白表達隨時間推移呈升高趨勢，明顯高于其他各組(P＜0.05);表明腦缺血再灌注導致大鼠腦損傷，使得大腦皮質(zhì)細胞的Bcl-2蛋白與mRNA表達增加。說明AP改善腦缺血再灌注所致腦皮質(zhì)神經(jīng)元損傷與增強Bcl-2蛋白與mRNA表達，干擾凋亡基因信號傳遞及抑制Ca2+的釋放而阻止神經(jīng)細胞的凋亡相關(guān)。

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