王 澤，黃鵬煌，趙海洋，李海燕，田海山，4，李校堃1，，4

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生物反應(yīng)器與藥物開(kāi)發(fā)教育部工程研究中心，吉林長(zhǎng)春 130021;2.溫州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，浙江溫州 325035; 3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130021;4.浙江格魯斯特生物科技有限公司，浙江溫州 325000)

角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2(keratinocyte growth factor-2，KGF-2)由成纖維細(xì)胞和其它間充質(zhì)來(lái)源的細(xì)胞分泌，能與表達(dá)于上皮細(xì)胞的激酶受體FGFR1Ⅲb和FGFR2Ⅲb相結(jié)合，通過(guò)間質(zhì)-上皮細(xì)胞相互作用的旁分泌方式發(fā)揮作用，特異性促進(jìn)上皮細(xì)胞的增殖、分化和遷移［1－2］。KGF-2與受體FGFR2Ⅲb的親和力很高，是其特異性配體。KGF-2與受體結(jié)合后，促使受體處于細(xì)胞內(nèi)的C端酪氨酸殘基磷酸化，磷酸化的受體具有酪氨酸蛋白激酶活性，并與一系列靶蛋白發(fā)生作用。其專(zhuān)一靶細(xì)胞是表皮細(xì)胞，能刺激所有皮膚內(nèi)的表皮基本單位包括毛囊、皮脂腺、汗腺生長(zhǎng)［3，4］。

表皮毛囊生長(zhǎng)受間質(zhì)和上皮細(xì)胞相互作用的調(diào)節(jié)，使其經(jīng)歷生長(zhǎng)期、退化期和終期的循環(huán)［5］。在循環(huán)中最主要的動(dòng)力是毛囊的間充質(zhì)，尤其是真皮乳突細(xì)胞。上皮干細(xì)胞，存在于毛囊的凸起部位，可以對(duì)來(lái)自真皮乳突細(xì)胞的感應(yīng)信號(hào)產(chǎn)生反應(yīng)［6］，對(duì)感應(yīng)信號(hào)的反應(yīng)可以刺激干細(xì)胞在毛囊凸起部位的增殖，然后子代干細(xì)胞向下生長(zhǎng)至真皮深處，于此同時(shí)毛母質(zhì)細(xì)胞開(kāi)始生長(zhǎng)并且復(fù)雜的毛囊結(jié)構(gòu)開(kāi)始形成。

KGF-2在真皮乳突細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，并且它的受體FGFR2Ⅲb在角蛋白細(xì)胞毗鄰的外根鞘中被發(fā)現(xiàn)［7］。KGF-2是毛囊細(xì)胞間質(zhì)衍生的刺激物。10 μg·L－1的KGF-2就可以刺激培養(yǎng)的人毛囊細(xì)胞明顯的生長(zhǎng)［8］。因此，KGF-2有望成為刺激人毛發(fā)生長(zhǎng)的治療劑。但目前對(duì)KGF-2在促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)方面的研究只限于細(xì)胞水平，本實(shí)驗(yàn)著重在動(dòng)物水平上證明KGF2能夠刺激毛發(fā)再生。

目前的治療藥物主要為化藥、中藥、保健品、洗發(fā)、護(hù)發(fā)素類(lèi)，尚未有基因工程藥物應(yīng)用于臨床。在本項(xiàng)研究中，KGF-2在治療人的脫發(fā)疾病上有望成為促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)的藥劑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及藥品 重組人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2凍干粉(浙江省生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備);SD大鼠，體質(zhì)量200 g左右，♂，60只，清潔級(jí)(溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心);重組人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(浙江省生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備);5%米諾地爾酊(商品名:蔓迪，浙江萬(wàn)馬藥業(yè))。

1.1.2 主要試劑及儀器 小動(dòng)物活體成像儀(美國(guó)CRi公司);0.9%氯化鈉注射液(浙江康樂(lè)藥業(yè));怡美寧異氟烷(山東科源制藥有限公司);小動(dòng)物專(zhuān)用吸入麻醉機(jī)(北京吉安得爾科技有限公司);薇婷脫毛膏(印度利潔時(shí)公司);光學(xué)顯微鏡(日本Nikon公司);石蠟包埋機(jī)(美國(guó)Thermo公司);石蠟切片機(jī)(美國(guó)Thermo公司);電子分析天平(瑞士MettlerToledo 公 司);CO2培 養(yǎng) 箱 (Thermo CELLBB15);二甲基亞砜DMSO(Gibco)

1.2 方法

1.2.1 四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)測(cè)定rh-KGF2活性 收集培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的NIH3T3細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100 μl，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，使待測(cè)細(xì)胞密度為5 000～10 000個(gè)/孔。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育至細(xì)胞貼壁，大約24 h。倒掉原培養(yǎng)液，換饑餓培養(yǎng)基(低糖DMEM+ 0.5%FBS)，每孔100 μl，饑餓培養(yǎng)18 h。加入100 mg·L－1的rhKGF2樣品溶液，每孔100 μl，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，進(jìn)行2倍梯度稀釋?zhuān)?個(gè)稀釋度。另選3個(gè)復(fù)孔加饑餓培養(yǎng)基做陰性對(duì)照，每孔100 μl。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h。每孔加入25 μl MTT溶液(5 g·L－1)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。倒掉液體，每孔加150 μl二甲基亞砜，混勻后，放入酶標(biāo)儀OD 570 nm (630 nm校準(zhǔn))測(cè)量各孔的吸光值，記錄測(cè)定結(jié)果。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立 參考文獻(xiàn)報(bào)道方法［9］建立動(dòng)物模型，大鼠經(jīng)異氟烷吸入麻醉后，在其背部制作(4×3)cm2的脫毛區(qū)，先用寵物推剪將實(shí)驗(yàn)區(qū)毛發(fā)推短至3～5 mm，再涂抹脫毛膏，作用3 min后用刮匙輕輕(以免損傷皮膚)刮去毛發(fā)，再用純凈水清洗實(shí)驗(yàn)區(qū)，除去殘余的脫毛膏。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 造模次日，選取造模成功的大鼠，利用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件根據(jù)初始體重進(jìn)行隨機(jī)分組，即正常對(duì)照組、5%米諾地爾組(50 g· L－1)、aFGF組(4 mg·L－1)、rhKGF2高(100 mg· L－1)、中(50 mg·L－1)、低(10 mg·L－1)劑量組、0.9%生理鹽水組。每組大鼠8只。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥 每日給藥1次(正常對(duì)照組除外)，連續(xù)給藥14 d。每次給藥前先用75%酒精進(jìn)行實(shí)驗(yàn)區(qū)常規(guī)消毒，再用0.5 mm的滾針在實(shí)驗(yàn)區(qū)來(lái)回滾3次(5%米諾地爾組除外)，最后用無(wú)菌棉棒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)區(qū)皮膚涂抹給藥。5%米諾地爾組每次涂抹1 ml，aFGF組、rhKGF2高、中、低劑量組、0.9%生理鹽水組每次涂抹300 μl。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重記錄 以給藥第1、5、9、14天為主要觀察、記錄時(shí)間點(diǎn)，稱(chēng)量各組大鼠的體重并記錄。

1.2.6 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物脫毛區(qū)毛長(zhǎng)記錄 以給藥第1、5、9、14天為主要觀察，記錄時(shí)間點(diǎn)，拔取脫毛區(qū)最長(zhǎng)毛8根，放大鏡下用游標(biāo)卡尺測(cè)定長(zhǎng)度，并計(jì)算平均值，作為各大鼠脫毛區(qū)新生毛的長(zhǎng)度，再計(jì)算每組大鼠毛發(fā)均值。

1.2.7 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物脫毛區(qū)毛發(fā)生長(zhǎng)狀況觀察 以給藥第1、5、9、14天為主要觀察、記錄時(shí)間點(diǎn)，對(duì)大鼠背部脫毛區(qū)進(jìn)行照相機(jī)拍照記錄(正常對(duì)照組除外)。

1.2.8 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物脫毛區(qū)毛重記錄 于給藥第14天刮取大鼠脫毛區(qū)全部體毛，用萬(wàn)分之一電子分析天平稱(chēng)重，作為各大鼠脫毛區(qū)新生毛的重量，再計(jì)算每組大鼠毛重均值(正常對(duì)照組除外)。

1.2.9 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物脫毛區(qū)皮膚組織病理學(xué)檢查 于給藥第14天處死大鼠，切取各組(正常對(duì)照組除外)大鼠背部脫毛區(qū)相同位置皮膚組織塊，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，切片厚約7 μm，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)均以±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 rhKGF2活性測(cè)定結(jié)果 rhKGF2處理NIH3T3細(xì)胞48 h后，在1～100 mg·L－1之間rh-KGF2對(duì)NIH3T3細(xì)胞有明顯的促進(jìn)增殖作用，呈現(xiàn)出良好的蛋白活性，且呈現(xiàn)劑量－效應(yīng)關(guān)系。結(jié)果見(jiàn)Fig 1。

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立成功 造模次日，觀察大鼠背部脫毛區(qū)皮膚，表面光滑，無(wú)過(guò)敏、紅腫、損傷現(xiàn)象出現(xiàn)，提示造模成功。

2.3 給藥第1、5、9、14天實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重變化 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，各組體重均呈現(xiàn)正常增長(zhǎng)趨勢(shì)，差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。說(shuō)明各組受試藥品對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠的正常生長(zhǎng)無(wú)影響。結(jié)果見(jiàn)Fig 2。

2.4 給藥第1、5、9、14天實(shí)驗(yàn)動(dòng)物脫毛區(qū)毛發(fā)生長(zhǎng)長(zhǎng)度變化 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給藥前各組大鼠背部脫毛區(qū)毛發(fā)均被全部去除(正常對(duì)照組除外)。在給藥第5、9、14天，與正常對(duì)照組相比，0.9%生理鹽水組毛發(fā)長(zhǎng)度變短，差異有顯著性(P＜0.01);在給藥第5、9天，與0.9%生理鹽水組相比，rhKGF2高、中劑量組差異有顯著性(P＜0.05，P＜0.01)，rhKGF2低劑量組無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，5%米諾地爾組、aFGF組存在顯著性差異(P＜0.01);在給藥第14天，與0.9%生理鹽水組相比，rhKGF2高、中、低劑量組差異有顯著性(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05)，5%米諾地爾組、aFGF組差異有顯著性(P＜0.01，P＜0.01)。結(jié)果見(jiàn)Fig 3。

Fig 1 rhKGF2 stimulated NIH3T3 cell proliferation assay

Fig 2 Body weight of the experimental SD rats(±s，n=8)

2.5 給藥第14天實(shí)驗(yàn)動(dòng)物脫毛區(qū)毛發(fā)重量變化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在給藥第14天，與0.9%生理鹽水組比較，5%米諾地爾組、aFGF組、rhKGF2高、中、低劑量組均差異有顯著性(P＜0.01)。結(jié)果見(jiàn)Fig 4。

2.6 給藥第1、5、9、14天實(shí)驗(yàn)動(dòng)物脫毛區(qū)毛發(fā)生長(zhǎng)狀況 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在給藥第1天，各組大鼠脫毛區(qū)皮膚光滑、紅潤(rùn)，無(wú)紅腫、損傷現(xiàn)象出現(xiàn)，無(wú)殘損毛發(fā)存在;在給藥第5天，各組大鼠脫毛區(qū)毛發(fā)均呈現(xiàn)生長(zhǎng)狀態(tài)，5%米諾地爾組、rhKGF2中劑量組、aFGF組呈現(xiàn)較為明顯，并且毛發(fā)生長(zhǎng)密度均勻;在給藥第9天，可見(jiàn)5%米諾地爾組、rhKGF2中劑量組、aFGF組明顯變長(zhǎng)，并且毛發(fā)生長(zhǎng)密度變大。rhKGF2高劑量組也呈現(xiàn)明顯的生長(zhǎng)狀態(tài);在給藥第14天，可見(jiàn)5%米諾地爾組、rhKGF2中劑量組、aFGF組已基本恢復(fù)到正常毛發(fā)長(zhǎng)度水平，rhKGF2高、低劑量組和0.9%生理鹽水組毛發(fā)生長(zhǎng)狀態(tài)明顯，但毛發(fā)密度不均。需要注意的是，rhKGF2高、低劑量組之間并無(wú)明顯差異，但中劑量組較高、低劑量組而言，效果明顯。結(jié)果見(jiàn)Fig 5。

Fig 3 Hair length of the experimental rats(±s，n=8)

Fig 4 Hair weight of the experimental rats(±s，n=8)

Fig 5 Hair growth conditions of the experimental rats

2.7 給藥第14天實(shí)驗(yàn)動(dòng)物脫毛區(qū)皮膚組織病理學(xué)檢查 組織病理切片結(jié)果顯示，在100倍光鏡下，給藥第14天，5%米諾地爾組、aFGF組、rhKGF2中劑量組真皮及皮下組織中可見(jiàn)大量新生毛囊及新生的內(nèi)毛根鞘，無(wú)毛囊萎縮變小現(xiàn)象，膠原纖維正常，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，并且毛囊向下生長(zhǎng)至皮下，趨于成熟。真皮厚度已由毛發(fā)快速生長(zhǎng)期(變厚)恢復(fù)到正常水平。rhKGF2高、低劑量組真皮及皮下可見(jiàn)較多新生毛囊，并且在真皮及皮下的交界處有大量毛囊，說(shuō)明毛囊處于新生到成熟的過(guò)渡狀態(tài)，還未成熟，真皮厚度由毛發(fā)快速生長(zhǎng)期(變厚)向正常水平恢復(fù)(未恢復(fù)到正常厚度)。0.9%生理鹽水組真皮處可見(jiàn)大量新生毛囊，真皮厚度處于最厚階段(毛發(fā)快速生長(zhǎng)期)。結(jié)果見(jiàn)Fig 6。

Fig 6 Taking the experimental skin for histopathological examination(HE×100)

3 討論

毛發(fā)疾病特別是斑禿，困擾著無(wú)數(shù)的患者，它所帶來(lái)的心理壓力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于疾病本身，雖有很多宣傳治療脫發(fā)的產(chǎn)品，但大多數(shù)均為衛(wèi)消字、衛(wèi)健字、衛(wèi)妝字、衛(wèi)食字等產(chǎn)品，其效果往往難以保證，甚至?xí)?duì)治療者產(chǎn)生不良反應(yīng)。美國(guó)開(kāi)發(fā)了第一個(gè)治療脫發(fā)疾病的外用化學(xué)藥品－米諾地爾溶液，并獲得了FDA的批準(zhǔn)，成為目前唯一被批準(zhǔn)治療脫發(fā)的OTC藥物。該藥物經(jīng)頭皮吸收后可以擴(kuò)張頭皮下血管，改善毛囊周?chē)奈⒀h(huán)［10］，減少毛囊周?chē)难装Y細(xì)胞浸潤(rùn)，延緩上皮基質(zhì)細(xì)胞的衰老，從而使萎縮的毛囊肥大并促進(jìn)毛發(fā)的生長(zhǎng)［11］。

近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，許多生物活性物質(zhì)，如角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2(KGF-2)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(aFGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)等對(duì)毛發(fā)生長(zhǎng)有明顯的調(diào)節(jié)作用，已成為該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)［12］。

本實(shí)驗(yàn)以5%米諾地爾溶液為陽(yáng)性藥物，比較rhKGF2對(duì)毛發(fā)生長(zhǎng)的作用效果，但是米諾地爾為化學(xué)類(lèi)藥物，而rhKGF2為蛋白類(lèi)藥物，二者之間存在著本質(zhì)的差別，所以在本實(shí)驗(yàn)中又設(shè)立了aFGF(4 mg·L－1)［13］陽(yáng)性藥物組，以便更充分的說(shuō)明 rh-KGF2對(duì)毛發(fā)生長(zhǎng)的作用效果。

與正常對(duì)照組比較，本研究中各組大鼠體重差異無(wú)顯著性(P＞0.05)，均呈現(xiàn)正常生長(zhǎng)趨勢(shì)，一定程度上說(shuō)明受試藥品對(duì)動(dòng)物的正常生長(zhǎng)不存在明顯影響。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，rhKGF2高、中、低劑量均對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠的毛發(fā)生長(zhǎng)有作用，以中劑量最為明顯。rhKGF2高劑量與低劑量二者之間比較，在毛發(fā)生長(zhǎng)方面的作用效果近似相同，而中劑量與二者比較卻效果顯著，說(shuō)明rhKGF2高劑量(100 mg·L－1)有可能是rhKGF2作用于毛發(fā)生長(zhǎng)的退行期劑量，另外本實(shí)驗(yàn)從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中推測(cè)中劑量(50 mg·L－1)到高劑量(100 mg·L－1)之間可能還存在比中劑量(50 mg·L－1)作用效果更好的劑量或平臺(tái)期劑量，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)確認(rèn)。rhKGF2中劑量組在毛發(fā)生長(zhǎng)長(zhǎng)度和毛發(fā)重量方面與5%米諾地爾組和aFGF組相比，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)上雖差異無(wú)顯著性，但由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，rhKGF2在毛發(fā)再生的作用效果上與5%米諾地爾(陽(yáng)性藥物)相當(dāng)，略強(qiáng)于aFGF(陽(yáng)性藥物)。病理切片結(jié)果顯示，在促進(jìn)毛囊新生與成熟方面，rhKGF2也表現(xiàn)較好的作用效果，并且不會(huì)引起皮膚病變。推測(cè)rhKGF2促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)的機(jī)制是由于刺激毛囊干細(xì)胞、毛母質(zhì)細(xì)胞的增殖與分化，并在一定程度上刺激毛囊上皮細(xì)胞的增殖與分化，從而促進(jìn)毛囊的新生與成熟。

本實(shí)驗(yàn)為基因工程蛋白類(lèi)藥物rhKGF2作為應(yīng)用于臨床治療脫發(fā)的候選藥物提供了有力依據(jù)?？梢蚤_(kāi)發(fā)成為比化學(xué)類(lèi)藥物更為安全的新一代治療禿發(fā)的產(chǎn)品。

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