石倩倩，丁亞輝，祁瑞哲，高瀛岱，楊 銘，紀(jì) 慶，羅 成

(1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457;2.南開(kāi)大學(xué)藥學(xué)院，天津 300071; 3.實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院(血液學(xué)研究所)，天津 300020)

白血病是嚴(yán)重威脅人類生命和健康的惡性疾病，據(jù)統(tǒng)計(jì)，白血病在我國(guó)的發(fā)病率為3－4/10萬(wàn)人。目前治療白血病的主要手段有化療、放療、骨髓移植等。在白血病的治療方法中，化療是常用和重要的治療手段，但常規(guī)化療藥易出現(xiàn)耐藥又有毒副作用，新設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)的靶向藥物伊馬替尼(格列衛(wèi))也沒(méi)有明顯提高白血病的治愈率，耐藥性的發(fā)生依然是困擾臨床治療的一大難題。多藥耐藥(multidrugresistance，MDR)是指腫瘤細(xì)胞對(duì)某一化療藥物產(chǎn)生耐藥性，對(duì)其他化學(xué)結(jié)構(gòu)及機(jī)制不同的化療藥物也產(chǎn)生交叉耐藥性。MDR是導(dǎo)致化療失敗最重要的原因之一，也是腫瘤治療中亟待解決的問(wèn)題。小白菊內(nèi)酯(PTL)是來(lái)源于菊科植物的倍半萜內(nèi)酯，一直用于治療偏頭疼和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。近來(lái)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，小白菊內(nèi)酯具有較強(qiáng)的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性，可誘導(dǎo)結(jié)腸癌、肝癌、多發(fā)性骨髓瘤、白血病、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌等腫瘤細(xì)胞凋亡，并對(duì)其他抗癌藥物具有增敏效應(yīng)［1－3］。

白血病細(xì)胞K562/ADR是一種對(duì)一線化療藥多柔比星、長(zhǎng)春新堿、伊馬替尼等耐藥的細(xì)胞系，本研究擬利用此細(xì)胞系研究小白菊內(nèi)酯對(duì)耐藥白血病細(xì)胞是否能有較強(qiáng)的殺傷作用，以及是否能誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞的凋亡。為解決白血病耐藥問(wèn)題尋找可能的解決辦法，為小白菊內(nèi)酯應(yīng)用于耐藥白血病的治療提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料

RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司;K562和阿霉素長(zhǎng)期誘導(dǎo)的耐藥細(xì)胞株K562/ADR由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)室提供;MTT購(gòu)自Sigma公司;RIPA細(xì)胞裂解液、Beyo ECL Plus顯色試劑、ROS檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)公司;細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自BD公司;LDH釋放試劑盒購(gòu)自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司;小白菊內(nèi)酯化合物由南開(kāi)大學(xué)陳悅教授實(shí)驗(yàn)室提供，純度為99.9%，溶于DMSO。

2 方法

2.1 MTT檢測(cè)藥物的抑制活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562和K562/ADR細(xì)胞，用含有10%血清的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109·L－1，接種于96孔板中，每孔180 μl。在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)1 h后，加入配制好的相應(yīng)濃度的藥20 μl，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，處理組加入不同濃度的藥，對(duì)照組加入相應(yīng)體積的生理鹽水。培養(yǎng)72 h后加入5 g· L－1的MTT 20 μl。37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清，每孔加入150 μl DMSO，震蕩混勻后在酶標(biāo)儀上檢測(cè)570 nm處光密度(OD)值。用軟件GraphPad Prism 5.01計(jì)算IC50值。

2.2 LDH釋放實(shí)驗(yàn)檢測(cè)藥物的細(xì)胞毒作用 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562和K562/ADR細(xì)胞，以不同濃度PTL處理24 h后加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，5× 104細(xì)胞/孔，同時(shí)按步驟要求設(shè)置空對(duì)照孔(無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)液)、樣品對(duì)照孔(未處理的對(duì)照細(xì)胞)、樣品最大酶活性對(duì)照孔(未處理的后續(xù)裂解的細(xì)胞)，加入裂解液和補(bǔ)充液后，在5%CO2條件下繼續(xù)孵育培養(yǎng)1 h，離心后吸取上清，按照操作步驟先后加入反應(yīng)底物和終止液。酶標(biāo)儀測(cè)定D492值后，按下式計(jì)算殺傷百分率:處理樣品實(shí)際吸光讀數(shù)÷樣品細(xì)胞最大酶活性的實(shí)際吸光讀數(shù)×100%

2.3 細(xì)胞凋亡分析檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞凋亡的作用取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562和K562/ADR細(xì)胞，以每孔1×108·L－1細(xì)胞懸液鋪入6孔板中，每孔2 ml。1 h后用不同濃度的藥物處理細(xì)胞。24 h后將6孔板中的細(xì)胞吸入流式管中。1 500 r·min－1離心7 min，棄上清，用1×Binding buffer將沉淀重懸，分別加入5 μl的Annexin-ⅤFITC和PI，室溫避光孵育15 min，加入300 μl的1×Binding buffer。FITC和PI的激發(fā)波長(zhǎng)分別為488 nm、488 nm，1 h內(nèi)進(jìn)行流式檢測(cè)(流式細(xì)胞儀為BD LSRII數(shù)字化分析型流式細(xì)胞儀)。凋亡率包括早期和晚期凋亡率。

2.4 ROS水平檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，加入10 μmol·L－1PTL作用1 h，取5×105個(gè)細(xì)胞，加入流式管中，離心后棄上清。預(yù)冷的PBS洗1遍，用稀釋的10 μmol·L－1DCF-DA探針37℃孵育30 min。離心棄上清，用300 μl PBS重懸，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，上機(jī)檢測(cè)。為了檢測(cè)ROS在細(xì)胞凋亡中的作用。用5 mmol·L－1NAC預(yù)處理細(xì)胞1 h，與10 μmol·L－1PTL共同處理1 h后，步驟同上，檢測(cè)ROS的變化;與10 μmol·L－1PTL共同處理24 h后，同“2.3”中的步驟，檢測(cè)凋亡率的變化。

2.5 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)的變化 藥物處理后收集細(xì)胞，PBS洗1遍，用RIPA裂解液置冰上裂解30 min，超聲波裂解提取蛋白。4℃，12 000 r ·min－1離心10 min。BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。12%的SDS-PAGE電泳分離上樣蛋白，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶4℃封閉非特異性抗原過(guò)夜，孵育一抗、二抗。ECL化學(xué)發(fā)光法與暗室顯影。

3 結(jié)果

3.1 PTL對(duì)K562/ADR的增殖抑制作用 不同濃度(1.25、2.5、5、10、15、20、50 μmol·L－1)的PTL處理細(xì)胞72 h后，PTL對(duì)K562/ADR有明顯的抑制細(xì)胞增殖的作用，并呈劑量依賴性。PTL對(duì)K562/ ADR細(xì)胞的IC50值為:(4.36±0.37)μmol·L－1。PTL對(duì)K562細(xì)胞的IC50值為:(3.62±0.79)μmol ·L－1，經(jīng)t檢驗(yàn)，P＞0.05，兩者差異無(wú)顯著性。如Fig 1所示。

Fig 1 MTT assay of PTL cytotoxicity to K562，K562/ADR(±s，n=6)

3.2 PTL對(duì)K562/ADR的細(xì)胞毒作用 PTL對(duì)K562/ADR有明顯的細(xì)胞毒作用，并呈劑量依賴性。PTL對(duì)K562/ADR細(xì)胞的LC50值為:(10.6±2.81) μmol·L－1。PTL對(duì)K562細(xì)胞的LC50值為:(9.04 ±2.63)μmol·L－1，經(jīng)t檢驗(yàn)，P＞0.05，兩者差異無(wú)顯著性。如Fig 2所示。

Fig 2 LDH assay of PTL cytotoxicity to K562，K562/ADR(±s，n=6)

3.3 PTL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率的測(cè)定 利用Annexin V-PI雙染法測(cè)定經(jīng)10 μmol·L－1PTL處理細(xì)胞24 h后的細(xì)胞凋亡率。如Fig 2所示，10 μmol·L－1PTL能誘導(dǎo)K562/ADR細(xì)胞凋亡，凋亡率為(31.21 ±0.40)%，K562細(xì)胞的凋亡率為(29.15± 3.45)%，兩者的凋亡率差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。結(jié)果說(shuō)明，PTL能夠誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞的凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤活性。

Fig 3 10 μmol·L－1PTL induced apoptosis of K562，K562/ADR for 24 h

3.4 PTL對(duì)K562/ADR細(xì)胞內(nèi)ROS的影響 為了探討PTL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是否與升高細(xì)胞內(nèi)的ROS相關(guān)，并激活下游的凋亡通路。用10 μmol· L－1PTL處理細(xì)胞1 h，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。結(jié)果顯示，10 μmol·L－1PTL處理細(xì)胞1 h，與對(duì)照相比，吸收峰明顯右移，如Fig 4所示。說(shuō)明K562/ ADR細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，與K562細(xì)胞相比差異無(wú)顯著性。為了驗(yàn)證ROS在PTL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程的作用，以N-乙酰半胱氨酸(NAC)為ROS的清除劑。NAC預(yù)處理1 h，PTL與NAC共同處理細(xì)胞1 h后，細(xì)胞內(nèi)ROS被抑制;PTL與NAC共同處理細(xì)胞24 h后，細(xì)胞 K562/ADR的凋亡率下降為(9.16±0.98)%，K562細(xì)胞的凋亡率為(5.24± 0.64)%。PTL單獨(dú)處理與PTL與NAC共同處理細(xì)胞凋亡率差異有顯著性(P＜0.05)。如Fig 5所示。

Fig 4 Increase of ROS in cells induced by PTL

Fig 5 Change of ROS level and apoptosis rate in K562，K562/ADR induced by PTL with NAC pretreatment

3.5 PTL誘導(dǎo)K562/ADR細(xì)胞內(nèi)caspase-3、9蛋白的活化以及下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá) 為了研究細(xì)胞凋亡的機(jī)制，我們檢測(cè)了 caspase-3、caspase-9、Bcl-2、Bax幾種關(guān)鍵的凋亡相關(guān)蛋白。結(jié)果顯示，10 μmol·L－1PTL處理細(xì)胞24 h，K562/ADR、K562細(xì)胞內(nèi)蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Bcl-2和Bax比值降低，caspase-3、caspase-9酶源被激活，caspase-3出現(xiàn)降解片段。NAC預(yù)處理后，其蛋白表達(dá)恢復(fù)。如Fig 6所示。結(jié)果說(shuō)明，PTL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在Bcl-2家族蛋白的參與下，由線粒體途徑介導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)。

Fig 6 Expression of proteins Bcl-2，caspase-3，caspase-9 induced by PTL and PTL+NAC

4 討論

目前認(rèn)為造成白血病發(fā)生、治療中耐藥和復(fù)發(fā)的根本原因是患者體內(nèi)存在著一群白血病干細(xì)胞(leukemia stem cell，LSC)。2005年，Jordan等發(fā)現(xiàn)PTL能特異性靶向作用于白血病干細(xì)胞，而且對(duì)正常造血干細(xì)胞影響較?。?］。目前推測(cè)PTL特異性靶向LSC的機(jī)制是:核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB在LSC中處于活化而在正常干細(xì)胞(HSC)中是非活化的，而PTL可以抑制 NF-κB的激活這一細(xì)胞生存途徑［5，13］。

我們的結(jié)果顯示，PTL能抑制耐藥白血病細(xì)胞K562/ADR的細(xì)胞增殖。10 μmol·L－1PTL處理細(xì)胞24 h能明顯誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞的凋亡，而且與K562細(xì)胞相比差異無(wú)顯著性。K562/ADR、K562對(duì)常用一線化療藥多柔比星、長(zhǎng)春新堿、格列衛(wèi)的耐藥倍數(shù)分別為約100倍、約100倍 、約10倍，而PTL對(duì)K562/ADR、K562兩種細(xì)胞的殺傷、凋亡差異無(wú)顯著性。這說(shuō)明PTL對(duì)耐藥白血病細(xì)胞的殺傷作用機(jī)制與其不同。

在通常情況下，急性、高濃度的ROS損傷DNA、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)，引起細(xì)胞凋亡、壞死［6－9］。當(dāng)胞內(nèi)的ROS水平較高時(shí)，細(xì)胞色素C(CytC)從線粒體被釋放到胞質(zhì)中，下調(diào)Bcl-2有助于CytC的釋放。胞質(zhì)中的CytC與凋亡激活因子(apoptosis activating factor-1，Apaf-1)及pro-caspase-9形成凋亡小體，pro-caspase-9自身激活，形成有活性的caspase-9，后者進(jìn)一步激活caspase-3、6、7等，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［10－12］。Western blot結(jié)果顯示，PTL均能夠下調(diào)Bcl-2，pro-caspase-9、pro-caspase-3蛋白的表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。用NAC預(yù)處理后，能恢復(fù)它們的表達(dá)。這說(shuō)明PTL對(duì)凋亡的誘導(dǎo)作用與ROS的參與相關(guān)。

綜上，PTL對(duì)耐藥白血病細(xì)胞具有較好的抑制活性，并誘導(dǎo)其凋亡，可能的機(jī)制是其刺激細(xì)胞內(nèi)的ROS升高，下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，進(jìn)而激活線粒體凋亡通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。PTL有可能成為治療臨床耐藥白血病的潛在藥物。

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