盧海慶，李 俊，劉成軍，韋世秀，張學(xué)榮，李牡艷

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，2.廣西壯族自治區(qū)江濱醫(yī)院，3.廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)實驗中心，廣西南寧 530021)

鱟(horsefoot)是一種的海洋動物，鱟血細(xì)胞目前主要用于制備鱟試劑。研究顯示［1］，制備鱟試劑后的鱟血漿中含有較多的SOD。SOD是公認(rèn)的最重要的抗氧化劑，生物體內(nèi)重要的抗氧化酶。它能催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，平衡機體內(nèi)的氧自由基，在防御氧的毒性，抗輻射損傷及預(yù)防衰老等方面起著重要作用，是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)?？寡趸侵苯幼饔迷谧杂苫?，或是間接消耗掉容易生成自由基的物質(zhì)，防止發(fā)生進一步反應(yīng)。目前，國內(nèi)外大量報道了從動物肝臟、雞紅等［2－3］原料中提取的 SOD在炎癥、自身免疫性疾病、輻射、衰老以及缺血后再灌注損傷等多種疾病中的治療作用［4］，但對從鱟血中提取的SOD的作用研究尚未有報道。本研究通過建立D-半乳糖致衰老小鼠模型［5］，檢測模型小鼠血清、肝臟和腦SOD、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活力及丙二醛(MDA)含量，探討鱟血中SOD的抗氧化作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑 鱟血SOD凍干粉，本實驗室自提取。D-半乳糖，批號:20100926，美國Amresco公司。測總SOD試劑盒，批號:20101127;MDA含量測定試劑盒，批號:20101124;GSH-Px活力測試試劑盒，批號:20101125;考馬斯亮藍(lán)法蛋白質(zhì)定量試劑盒，批號:20101125;雙縮脲法蛋白質(zhì)定量試劑盒，批號:20101124，均為南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。維生素E粉末，批號:20100820，浙江新和成有限公司生產(chǎn)，純度:99.1%。

1.1.2 動物 SPF級昆明小鼠，96只，♂♀各半，體質(zhì)量(20±2)g，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證:SCXK(桂)2009-0002。

1.1.3 主要儀器 雙束光紫外分光光度計為美國VARIAN公司產(chǎn)品;高速低溫離心機為德國Eppendorf Centrifuge公司產(chǎn)品;高速分散均質(zhì)機為上海標(biāo)本模型廠產(chǎn)品;三用恒溫水箱為北京長源實驗設(shè)備廠產(chǎn)品;混勻器為上海滬西分析儀器廠產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及給藥 將小鼠隨機分為空白對照組、衰老模型組、維生素E組，鱟血SOD高、中、低劑量組，每組16只?？瞻讓φ战M頸背部注射生理鹽水，其余各組按120 mg·(kg·d)－1［6］頸背部注射D-半乳糖造模，同時維生素E組和鱟血SOD高、中、低劑量組分別灌胃給藥100 mg·(kg·d)－1［7］、231.84 mg·(kg·d)－1、115.92 mg·(kg·d)－1、57.96 mg·(kg·d)－1，連續(xù)造模給藥42 d［8］。

1.2.2 小鼠體征行為學(xué)觀察 觀察和記錄小鼠體征和活動情況，如背毛光澤度、對刺激反應(yīng)的靈敏度、采食狀況、嗜睡程度等，以及死亡情況。每周記錄體重一次。

1.2.3 小鼠血清、肝臟、腦中的SOD、GSH-Px活力及MDA含量的測定 采用黃嘌呤氧化酶法和DTNB比色法分別測定肝臟、血清、腦中的 SOD和GSH-Px活力;運用硫代巴比妥酸比色法測定MDA含量。

2 結(jié)果

2.1 鱟血SOD對小鼠體征行為的影響 給藥前各組小鼠情況良好。給藥2周后與空白對照組相比，模型組小鼠進食減少，活動緩慢，扎堆嗜睡，毛發(fā)粘濕缺乏光澤，且背部毛發(fā)有脫落現(xiàn)象。鱟血SOD各劑量組小鼠一般狀況介于模型組和空白組之間，但稍差于維生素E組;除空白組外，各組小鼠體重增加量普遍下降，在整個實驗過程中，衰老模型組小鼠體重增加量明顯小于空白組小鼠體重增加量;鱟血SOD各劑量組小鼠體重增加量與衰老模型組小鼠體重增加量相比沒有明顯差異;維生素E組小鼠體重增加量和空白組小鼠體重增加量相當(dāng)。

2.2 鱟血SOD對小鼠血清中SOD、GSH-Px活力及MDA含量的影響 與空白組相比，衰老模型組的SOD、GSH-Px活力明顯下降(P＜0.05)，MDA含量明顯升高(P＜0.01);與衰老模型組比較，維生素E組和鱟血 SOD高、中、低劑量組均能明顯提高SOD、GSH-Px活力(P＜0.01，P＜0.05)，降低MDA含量(P＜0.05)。結(jié)果見Tab 1。

Tab 1 Effects of horsefootblood SOD on SOD，GSH-Px activities and the MDA content in mice serum(±s)

Tab 1 Effects of horsefootblood SOD on SOD，GSH-Px activities and the MDA content in mice serum(±s)

★P＜0.05，★★P＜0.01 vs control group;▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs model group

Group n SOD/U·ml－1 GSH-Px/U·ml－1 MDA/μmol·L －1 Control 16 148.26±25.91 273.27±56.30 11.43±1.09 Model 13 127.88±20.14★ 227.89±51.38★ 13.82±2.01★★VitE 14 160.06±13.45▲▲ 311.56±21.24▲▲ 11.73±1.79▲SOD-H 11 164.73±20.16▲▲ 280.26±33.97▲ 12.19±0.91▲SOD-M 10 156.96±24.94▲▲ 327.58±27.22▲▲ 12.44±1.07▲SOD-L 12 158.55±18.35▲▲ 293.39±29.33▲▲ 12.35±1.58▲

2.3 鱟血SOD對小鼠肝臟中SOD、GSH-Px活力及MDA含量的影響 與正常對照組比較，模型組小鼠肝臟中SOD、GSH-Px活力降低(P＜0.05)，MDA含量升高(P＜0.05);與衰老模型組比較，維生素E組，鱟血SOD高、中劑量組能明顯提高小鼠肝臟中SOD活力(P＜0.01)，但對GSH-Px活力基本沒有影響，維生素E組能明顯降低MDA含量(P＜0.01)，鱟血SOD給藥組均未能明顯降低MDA含量。結(jié)果見Tab 2。

Tab 2 Effects of horsefootblood SOD on SOD，GSH-Px activities and the MDA content in mice liver(±s)

Tab 2 Effects of horsefootblood SOD on SOD，GSH-Px activities and the MDA content in mice liver(±s)

★P＜0.05，★★P＜0.01 vs control group;▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs model group

Group n SOD/U·mg－1 GSH-Px/U·mg－1 MDA/μmol·g －1 Control 16 189.14±40.93 398.85±62.99 2.65±0.80 Model 13 146.19±41.07★ 339.97±70.32★ 3.54±1.19★★VitE 14 243.07±39.27▲▲ 330.91±55.23 2.23±0.81▲▲SOD-H 11 230.12±18.90▲▲ 312.99±46.59 2.71±0.86 SOD-M 10 212.46±42.44▲▲ 369.15±78.5 3.41±0.74 SOD-L 12 156.59±19.11 342.65±38.50 2.70±0.91

2.4 鱟血SOD對小鼠大腦中SOD、GSH-Px活力及MDA含量的影響 與空白對照組比較，模型組小鼠大腦中SOD、GSH-Px活力降低(P＜0.01)，MDA含量升高(P＜0.05);與衰老模型組比較，維生素E組和鱟血SOD高、中、低劑量組均可明顯提高大腦中GSH-Px活力(P＜0.01)，明顯降低MDA含量(P＜0.01)，但對SOD活力的影響沒有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果見Tab 3。

Tab 3 Effects of horsefootblood SOD on SOD，GSH-Px activities and the MDA content in mice brain(±s)

Tab 3 Effects of horsefootblood SOD on SOD，GSH-Px activities and the MDA content in mice brain(±s)

★P＜0.05，★★P＜0.01 vs control group;▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs model group

Group n SOD/U·mg－1 GSH-Px/U·mg－1 MDA/μmol·g －1 Control 16 147.26±27.07 30.70±13.88 5.16±1.53 Model 13 85.04±14.07★★ 10.78±2.82★★ 6.91±1.62★VitE 14 87.08±18.07 39.36±11.24▲▲ 4.67±0.89▲▲SOD-H 11 76.16±11.77 28.69±9.00▲▲ 4.71±0.58▲▲SOD-M 10 80.27±16.85 29.92±7.72▲▲ 5.05±0.80▲▲SOD-L 12 75.63±11.23 21.51±6.47▲▲6.62±1.47

3 討論

SOD是生物活性大分子酶，雖然實驗表明其免疫原性很低，但研究表明［9］多次注射仍有抗體的產(chǎn)生，所以口服不僅是一條方便而簡單的途徑，而且可以避免免疫反應(yīng)的產(chǎn)生。袁勤生等［10］研究了SOD在口服吸收過程中對胃、腸道內(nèi)胃酸及蛋白水解酶失活的耐受力，及小鼠SOD口服后血細(xì)胞中SOD的活力變化情況，結(jié)果肯定了SOD在胃腸道是穩(wěn)定的，能直接被吸收利用，可作為藥物進入血液治療疾病。目前，國外把SOD作為食品添加劑加在牛奶、可溶性咖啡、啤酒中，我國貴州農(nóng)學(xué)院已開發(fā)出刺梨SOD飲料［11］。因此，本實驗采用灌胃的方式給小鼠用藥是可行的。如果能對鱟血中SOD進行結(jié)構(gòu)修飾或者加入穩(wěn)定劑，可能會增強其耐熱，耐極端pH和抗蛋白酶水解能力。

自由基是機體氧化反應(yīng)中產(chǎn)生的有害化合物，具有強氧化性，可損害機體的組織和細(xì)胞，進而引起慢性疾病及衰老效應(yīng)。機體同時存在自由基清除系統(tǒng)(包括SOD、GSH-Px、過氧化氫酶等抗氧化酶)，自由基的產(chǎn)生和清除是一種動態(tài)平衡狀態(tài)。SOD是體內(nèi)最重要的酶類抗氧化劑，它可直接清除O2－，其活性間接反映機體清除氧自由基的能力;GSH-Px是機體內(nèi)廣泛存在的一種含硒抗氧化酶，它可以催化H2O2還原成H2O，因此GSH-Px活性的高低可以作為評價組織細(xì)胞衰老的又一個重要指標(biāo)［12］;而MDA是自由基損傷不飽和脂肪酸生成的脂類過氧化分解產(chǎn)物，是衡量機體內(nèi)自由基代謝的敏感指標(biāo)［13］。本研究通過建立D-半乳糖衰老小鼠模型，檢測小鼠血清、肝臟、腦中的SOD、GSH-Px活力及MDA含量的變化來研究鱟血中SOD的抗氧化作用。實驗結(jié)果顯示，衰老模型組小鼠血清、肝臟和腦中SOD、GSH-Px活力明顯下降，MDA的含量明顯升高，說明造模成功。鱟血中SOD對衰老小鼠血清、肝臟和腦中SOD、GSH-Px活力，MDA含量的影響具有明顯的器官差異性。這可能是鱟血SOD對不同器官組織的抗氧化作用有差異，也可能與各組織的細(xì)胞代謝狀態(tài)有關(guān)。實驗結(jié)果高、中、低劑量的數(shù)據(jù)不是呈遞增或遞減趨勢，可能是由于藥物沒有呈現(xiàn)出量效相關(guān)性，也可能存在一些不可避免的實驗誤差。有的指標(biāo)可能是中劑量效果好，有的指標(biāo)則可能是低劑量效果好，并不是所有的指標(biāo)藥物使用的劑量越高其效果就會越好。

［1］ 李 俊，韋世秀.鱟血中超氧化物歧化酶的提取及部分性質(zhì)的研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2011，22(4):842－4.

［1］ Li J，Wei S X.Purification and some properties of superoxide dismutase from horsefoot blood［J］.Lishizhen Med Mater Med Res，2011，22(4):842－4.

［2］ 吳燕燕，李來好，郝志明.羅非魚肝臟中超氧化物歧化酶的提取、純化與分析［J］.水產(chǎn)學(xué)報，2007，31(4):518－24.

［2］ Wu Y Y，Li L H，Hao Z M.Extraction，purification and analysis of superoxide dismutase from liver of hybrid tilapia［J］.J Fisheries China，2007，31(4):518－24.

［3］ 張?zhí)m杰，侯冬巖，辛 廣.雞紅細(xì)胞Cu，Zn-SOD的純化及部分性質(zhì)研究［J］.食品科學(xué)，2008，29(2):266－70.

［3］ Zhang L J，Hou D Y，Xin G.Study on purification and properties of Superoxide Dismutase from erythrocytes of chicken［J］.Food Sci，2008，29(2):266－70.

［4］ Takemura T.A clinical trial of recombinant human superoxide dismutase for myocardial protection［J］.Nippon Kyobu Geka Gakkai Zasshi，1993，41(2):247－53.

［5］ 陳 瑩，才 媛，王 琦.裂褶菌胞外多糖對D-半乳糖致衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶及代謝產(chǎn)物的影響［J］.中國藥理學(xué)通報，2012，28(2):274－7.

［5］ Chen Y，Cai Y，Wang Q.Schizophyllum commune extracellular polysaccharide on D galactose induced aging mice with learning and memory［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28(2):274－7.

［6］ 趙利華，文建軍，楊 柯.艾灸對D-半乳糖致小鼠衰老模型抗衰老作用的研究［J］.針刺研究，2008，33(4):255－61.

［6］ Zhao L H，Wen J J，Yang K.Effects of moxibustion on cerebral cortical nitric oxide level and nitric oxide synthase activity in aging mice［J］.Acupunct Res，2008，33(4):255－61.

［7］ 康 樺，匡 榮.α-硫辛酸抗D-半乳糖所致小鼠衰老作用研究［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報，2008，27(8):896－8.

［7］ Kang H，Kuang R.Antiaging effect of α-lipoic acid on D-galactose induced aging mice［J］.Herald Med，2008，27(8):896－8.

［8］ 吳 波，付玉梅.肉蓯蓉總苷對亞急性衰老小鼠抗脂質(zhì)過氧化作用的研究［J］.中國藥理學(xué)通報，2005，21(5):639.

［8］ Wu B，F(xiàn)u Y M.Study on anti-lipid peroxide effect of the glycoside Of cistanche in the subacute agingmice［J］.Chin Pharmacol Bull，2005，21(5):639.

［9］ Adachi T，Usami Y，Kishi T，et al.An enzyme immunoassay for cuprozinc superoxide dismutase using monoclonal antibodies.Application for pharmacokinetic study［J］.J Immun Meth，1988，109: 93.

［10］袁勤生，崔玉敏，張炳然.口服SOD的穩(wěn)定性及吸收途徑研究［J］.藥物生物技術(shù)，1994，1(1):24.

［10］Yuan Q S，Cui Y M，Zhang B R.Studies on the stability and absorption of superoxide dismutase peros in rats［J］.Pharm Biotechnol，1944，1(1):24.

［11］黎瑞珍，楊慶建，陳貽銳.超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定及其應(yīng)用研究［J］.瓊州大學(xué)學(xué)報，2004，11(5):34－6.

［11］Li R Z，Yang Q J，Chen Y R.Study of determination of superoxide dismutase(SOD)activation and application［J］.J Qiongzhou Univ，2004，11(5):34－6.

［12］Reiter R.Biomarkers of free radical damage:applications in experimental animals and in human［J］.Jpineal Pea，1995，18:1－11.

［13］Inal M E，Kanbak G，Sunal E.Antioxidant enzyme activities and malondial dehy delevels related to aging［J］.Clin Chim Acta，2001:305(12):75－8.