張吉仲，萬 謙，劉 圓

(1.西南民族大學(xué)民族藥物研究院，四川成都 610041;2.成都中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，四川成都 610041)

白花丹是指藍(lán)雪科植物白花丹Plumbago zeylanica L.的干燥根、根莖及全草，是東南亞多個(gè)國(guó)家及其中國(guó)常用藥材。在我國(guó)，其主要生長(zhǎng)于四川、福建、廣西、廣東等地區(qū)，主要具有祛風(fēng)散瘀、解毒殺蟲、消腫止痛等作用［1－2］。白花丹醌(plumbagin)為白花丹的主要活性成分［3］，經(jīng)檢驗(yàn)其具有廣泛的藥理作用，如抗炎、抗凝等。

目前有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明:白花丹醌對(duì)卵巢癌［4］、乳腺癌［5］、胃腸道腫瘤［6］等具有一定的抗腫瘤活性。肝癌為一種人類常見的高度惡性腫瘤，其浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)，預(yù)后差。

本研究旨在通過體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)白花丹醌對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2和SMMC-7721生長(zhǎng)的影響機(jī)制，以期研究其對(duì)肝癌細(xì)胞的抗腫瘤活性。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 HepG2、SMMC-7721，購(gòu)買自四川大學(xué)法醫(yī)與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所。

1.2 主要藥物及試劑 白花丹醌(本實(shí)驗(yàn)室制備，純度 98%);3-(4，5-Dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide(MTT):Sigma，M2003，美國(guó);RNA提取試劑盒:MRC，Tri Reagent，美國(guó); DEPC:BBI，加拿大;cDNA合成試劑盒:MBI，RevertAidTMH Minus First Strand cDNA Synthesis kit，立陶宛;熒光定量PCR試劑盒(Qpcr):Roche，F(xiàn)aststart U-niversal SyBr Green Master(Rox)，瑞士。

引物合成:從NCBI網(wǎng)站查得Bax、Bcl-2、Cyclin D1和β-actin的全基因序列;利用軟件Primer Express 3.0設(shè)計(jì)引物，設(shè)計(jì)時(shí)擴(kuò)增長(zhǎng)度選定130 bp，其余參數(shù)選為默認(rèn)值。各基因的引物序列如Tab 1。

Tab 1 The primer sequences of the detected genes in Qpcr analysis

1.3 主要儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱:Thermo Scientific，F(xiàn)orma Series II Water Jacket，美國(guó);臺(tái)式高速冷凍離心機(jī):Thermo Scientific，Micro 17R，美國(guó);酶標(biāo)儀: Thermo Scientific，Multiskan Spectrum，美國(guó);DNA Engine PCR儀:MJ Research，PTC-200，美國(guó);實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀:Bio-Rad，CFX96型，美國(guó);倒置相差顯微鏡:Leica公司，DMI3000B，德國(guó)。

2 方法

2.1 檢測(cè)白花丹醌對(duì)HepG2和SMMC-7721細(xì)胞的半數(shù)抑制率(IC50) 以DMSO為溶劑，無菌條件下配制白花丹醌原始溶液，濃度為4.57 g·L－1。分別接種生長(zhǎng)良好HepG2、SMMC-7721細(xì)胞至96孔板，接種細(xì)胞量為1.5×104/孔，接種體積為180 μl/孔，5%CO2，37℃條件中培養(yǎng)過夜。第二天，往各孔中加入白花丹醌原始溶液，使得終濃度分別為0.0457、0.0228、0.0114、0.0057和0.0029 g·L－1，并調(diào)整使得每孔的DMSO溶劑為1%，每個(gè)濃度設(shè)7個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)7個(gè)復(fù)孔的陰性對(duì)照，陰性對(duì)照中只加入DMSO至終濃度為1%。而后，對(duì)細(xì)胞孔進(jìn)行顯微照像。然后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

48 h后，首先，對(duì)細(xì)胞孔進(jìn)行顯微照像，往各孔中加入20 μL的濃度為5 g·L－1的MTT溶液，然后將96孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育4h。取出96孔板，棄去每孔中的上清，往每孔中加入150 μl的DMSO，吹打3次。將96孔板置于酶標(biāo)儀于490 nm度數(shù)。根據(jù)讀數(shù)，利用Excel的相關(guān)統(tǒng)計(jì)公式計(jì)算IC50。

2.2 檢測(cè)白花丹醌對(duì)HepG2和SMMC-7721細(xì)胞的增殖及凋亡相關(guān)基因(Bax、Bcl-2、Cyclin D1)轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響 以2×105/孔的細(xì)胞量和3 ml/孔的體積接種HepG2、SMMC-7721細(xì)胞于6孔板。24 h后，往實(shí)驗(yàn)孔中加入4.57 g·L－1的白花丹醌原始溶液(由溶劑DMSO配制)至白花丹醌終濃度為0.0057 g·L－1，在對(duì)照孔中加入相應(yīng)體積的DMSO使其中DMSO的濃度與實(shí)驗(yàn)孔一致。在5%CO2，37℃下繼續(xù)培養(yǎng)48 h，分別使用RNA提取試劑提取RNA，再使用cDNA合成試劑盒合成cDNA，最后使用Qpcr試劑盒在熒光定量PCR儀上進(jìn)行熒光定量PCR分析，操作按試劑盒和儀器的說明書進(jìn)行。2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，數(shù)據(jù)以±s表示，采用獨(dú)立樣本student's t檢驗(yàn)分析比較各組間差異。

3 結(jié)果

3.1 白花丹醌抑制HepG2細(xì)胞的增殖 顯微照像分析表明:濃度低至0.0057 g·L－1的白花丹醌溶液在與HepG2共培養(yǎng)后能明顯改變細(xì)胞形態(tài)，改變后的細(xì)胞形態(tài)趨向細(xì)胞死亡形態(tài)(Fig 1)。說明白花丹醌抑制HepG2細(xì)胞的增殖。

檢測(cè)不同濃度的白花丹醌對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用，結(jié)果如Tab 2。結(jié)果表明:各個(gè)濃度的白花丹醌都對(duì)HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制，濃度低至0.0057 g·L－1時(shí)，仍有53.04%的抑制率。而后，通過利用 Excel軟件分析，計(jì)算得出白花丹醌對(duì)HepG2的半數(shù)抑制率(IC50)為0.0067 g·L－1。

Fig 1 The microscopic images of HepG2cultured with 1%DMSOor 0.0057 g·L－1plumbagin for 48 h

Tab 2 The inhibitory effect of plumbagin at different concentrations on the proliferation of HepG2

3.2 白花丹醌上調(diào)HepG2細(xì)胞的Bax/Bcl-2，下調(diào)Cyclin D1基因的轉(zhuǎn)錄水平 根據(jù)“3.1”所述的結(jié)果，將白花丹醌的干預(yù)濃度選定在0.0057 g·L－1，在該濃度下干預(yù)HepG2細(xì)胞48 h。提取被干預(yù)的HepG2細(xì)胞的mRNA，接著合成cDNA，進(jìn)行了QpcR檢測(cè)。選擇的被檢測(cè)的基因?yàn)?(1)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因 Bax和 Bcl-2;(2)細(xì)胞周期相關(guān)基因 Cyclin D1，選擇以β-actin基因作為內(nèi)參基因，檢測(cè)結(jié)果如Tab 3。結(jié)果表明:白花丹醌明顯上調(diào)了Bax/Bcl-2比值(P=0.0017)，同時(shí)明顯下調(diào)了Cyclin D1基因的轉(zhuǎn)錄水量(P=0.0287)。

Tab 3 Effect of plumbagin on the Bax/Bcl-2 ratio and the transcriptional level of Cyclin D1 gene of HepG2

3.3 白花丹醌抑制SMMC-7721細(xì)胞的增殖 顯微照像分析表明:濃度低至0.0057 g·L－1的白花丹醌溶液在與SMMC-7721共培養(yǎng)后能明顯改變細(xì)胞形態(tài)，改變后的細(xì)胞形態(tài)趨向細(xì)胞死亡形態(tài)(Fig 2)。說明白花丹醌抑制SMMC-7721細(xì)胞的增殖。

Fig 2 The microscopy images of SMMC-7721 cultured with 1% DMSO or 0.0057 g·L－1plumbagin for 48 h

檢測(cè)不同濃度的白花丹醌對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖的抑制作用，結(jié)果如Tab 4。結(jié)果表明:各個(gè)濃度的白花丹醌都對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制，濃度低至0.0057 g·L－1時(shí)，仍有88.48%的抑制率。而后，通過利用Excel軟件分析，計(jì)算得出白花丹醌對(duì)SMMC-7721的半數(shù)抑制率(IC50)為0.0012 g·L－1。

Tab 4 The inhibitory effect of plumbagin at different concentrations on the proliferation of SMMC-7721

3.4 白花丹醌上調(diào)SMMC-7721細(xì)胞的Bax/Bcl-2，下調(diào)Cyclin D1基因的轉(zhuǎn)錄水平 根據(jù)“3.3”所述的結(jié)果，將白花丹醌的干預(yù)濃度選定在0.0057 g ·L－1，在該濃度下干預(yù)SMMC-7721細(xì)胞2 d。然后，提取被干預(yù)的SMMC-7721細(xì)胞的mRNA，接著合成cDNA，進(jìn)行了QpcR檢測(cè)。選擇的被檢測(cè)的基因?yàn)?(1)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bax和Bcl-2;(2)細(xì)胞周期相關(guān)基因Cyclin D1，選擇以β-actin基因作為內(nèi)參基因，檢測(cè)結(jié)果如Tab 5。結(jié)果表明:白花丹醌明顯上調(diào)了Bax/Bcl-2比值(P=0.0104)，同時(shí)顯著下調(diào)了Cyclin D1基因的轉(zhuǎn)錄水量(P=0.0165)。

4 討論

白花丹醌是一種小分子萘醌化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為5-羥基-2-甲基-1，4-萘醌(5-hydroxy-2-methyL－1，4-napht--hoquinone)。其最早用于抗動(dòng)脈粥樣硬化、護(hù)肝、強(qiáng)心等。目前大量研究表明其對(duì)多種腫瘤細(xì)胞系有明顯抑制作用。Bharathi等［6］通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，白花丹醌能夠明顯地抑制氧化偶氮甲烷誘發(fā)的小腸腫瘤;Sandur等［7］的研究表明:白花丹醌有可能是通過抑制NF-kappaB通路而達(dá)到抗腫瘤作用;Nair等［8］研究表明:其可通過誘導(dǎo)凋亡增加宮頸癌細(xì)胞對(duì)放療的敏感性;劉超等［9－10］的研究表明:白花丹醌體外具有抑制人乳腺癌細(xì)胞mdamb-231生長(zhǎng)的作用。

Tab 5 Effect of plumbagin on the Bax/Bcl-2 ratio and the transcriptional level of Cyclin D1 gene of SMMC-7721

肝癌是我國(guó)癌癥死亡的第二大病因，晚期患者中位生存期短，目前的治療方法不能明顯延長(zhǎng)生存期。本研究首先以通過顯微照像發(fā)現(xiàn)白花丹醌對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2和SMMC-7721增殖有抑制，接著，MTT法檢測(cè)表明白花丹醌能明顯抑制人肝癌細(xì)胞HepG2和SMMC-7721的增殖，發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度增加，細(xì)胞存活率下降，而且對(duì)兩種細(xì)胞的IC50都低于0.0100 g·L－1。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，白花丹醌對(duì)SMMC-7721的抑制作用大于對(duì)HepG2的作用，其原因?qū)⒃谙乱徊窖芯恐刑骄??？偠灾?，上述結(jié)果表明白花丹醌能有效抑制兩種肝癌細(xì)胞的增殖。

通過對(duì)白花丹醌抑制機(jī)制的探討，發(fā)現(xiàn)其上調(diào)了HepG2和SMMC-7721的Bax/Bcl-2的比值，同時(shí)下調(diào)了Cyclin D1的轉(zhuǎn)錄水平。Bax/Bcl-2是凋亡相關(guān)指數(shù)［11］，其數(shù)值越高說明凋亡趨勢(shì)越明顯。Cyclin D1是細(xì)胞周期蛋白質(zhì)，其含量隨細(xì)胞周期的進(jìn)展而變化，在G1/S交界區(qū)含量最高［12］，由于培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞周期不同步，所以總有部分細(xì)胞處于G1/S交界區(qū)，所以Cyclin D1總能被檢測(cè)到，同時(shí)，其檢測(cè)出來的含量能初步反映整個(gè)細(xì)胞群的增殖活躍的程度。上述結(jié)果闡明了白花丹醌對(duì)兩種肝癌細(xì)胞增殖抑制的機(jī)制。

綜上所述，白花丹醌能有效抑制人肝癌細(xì)胞的增殖，其機(jī)制與Bax/Bcl-2比值的上調(diào)和Cyclin D1轉(zhuǎn)錄水平的下調(diào)有關(guān)，說明白花丹醌具有抗肝癌的作用。

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