謝捷明，楊愛琴，王叢菲，黃鶴光，張寶明，吳雪燕，陳明晃

(1.福建醫(yī)科大學藥學院藥理學系，福建福州 350004;2.福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院基本外科，福建福州 350001; 3.中國科學院福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究所，結(jié)構(gòu)化學國家重點實驗室，福建福州 350002)

胰腺癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，其惡性度高、早期診斷率低、預后差，且發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈逐年上升趨勢，已成為威脅人類健康的主要疾病之一［1］。目前手術(shù)治療是唯一有效可行的治療胰腺癌的方法，但患者5年生存率也僅達15%～25%［2］。對于中晚期的胰腺癌患者而言，以化療為主的綜合治療方案是目前胰腺癌的重要治療手段。自1996年吉西他濱(gemcitabine，GEM)問世以來，其在胰腺癌化療中的地位一直未被替代［3］。然而GEM緩解率較低、存在固有及獲得性耐藥現(xiàn)象以及其嚴重的毒副作用限制了其在臨床中的應用［4］。近年，隨著與胰腺癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子標記物的逐步闡明，針對胰腺癌的特異性分子靶點設計的抗腫瘤藥物相繼產(chǎn)生，其中就有針對表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)的酪氨酸激酶抑制劑，代表藥物如厄洛替尼、吉非替尼，但此類藥物也未能從本質(zhì)上提高患者的五年生存率［5］。因此研發(fā)一種新型的高效、低毒、多靶點作用的藥物，尤其是能與現(xiàn)有化療藥物產(chǎn)生協(xié)同作用的聯(lián)合治療方案具有重要的意義。

南瓜蛋白(cucurmosin，CUS)是本課題組率先從南瓜果肉中提取的新的Ⅰ型核糖體失活蛋白，相對分子質(zhì)量28 203，為堿性單肽鏈糖蛋白，其一、二、三級結(jié)構(gòu)已測定［6－8］。我們前期的研究表明，CUS能顯著抑制多種腫瘤細胞增殖，且活性比同類的天花粉蛋白強2～7倍［9－17］;本課題組近期實驗證實，CUS可在翻譯水平明顯下調(diào)人胰腺癌BxPC-3細胞EGFR蛋白的表達，抑制EGFR信號通路可能是CUS抗胰腺癌作用的重要機制［18］。本研究以人胰腺癌BxPC-3細胞作為對象，進一步探索CUS聯(lián)合GEF的協(xié)同抗胰腺癌作用，旨在探尋新的胰腺癌化療的有效聯(lián)合方案。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑 人胰腺癌細胞株BxPC-3購自上海生命科學研究院。CUS由本課題組提取制備，純度為97%，采用BCA法進行蛋白質(zhì)定量，過濾除菌后分裝，－70℃冰箱保存;實驗時用培養(yǎng)液稀釋為不同濃度使用。RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清均購自美國Gibco公司。吉非替尼購于英國阿斯利康公司，取GEF片充分研磨后精密稱定，用一定量的二甲基亞楓(DSMO)溶解，使之終濃度為50 mmol· L－1，置4℃?zhèn)溆?。二甲基亞楓、磺酰羅丹明B(Sulforhodamine B，SRB)和吉姆薩染料(Giemsa)均為美國Sigma公司產(chǎn)品。BCA蛋白濃度測定試劑盒購于南京凱基生物科技公司。EGFR抗體購自Bioworld公司，Actin抗體及二抗購自美國Pierce公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 細胞培養(yǎng) BxPC-3細胞用含質(zhì)量分數(shù)10%胎牛血清及80 KU·L－1慶大霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，置37℃、5%CO2及飽和濕度條件下常規(guī)貼壁培養(yǎng)，2～3 d傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.3 SRB法測定CUS與GEF聯(lián)合應用對BxPC-3細胞增殖的影響 用質(zhì)量分數(shù)為0.25%的胰酶(含質(zhì)量分數(shù)為0.02%的 EDTA)消化BxPC-3細胞，培養(yǎng)液重懸制備成單細胞懸液，以每孔6 000個細胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板，置培養(yǎng)箱內(nèi)24h待細胞貼壁后加入干預藥物。實驗設CUS干預組、GEF干預組、聯(lián)合用藥組及陰性對照組:CUS干預組藥物的終濃度分別為 0.0078125、0.015625、0.03125、0.0625、0.125及0.25 μmol·L－1，GEF干預組藥物終濃度分別為2、4、8及16 μmol·L－1，聯(lián)合用藥組為上述兩組藥物各濃度的兩兩組合，陰性對照組未加入藥物;每組均設4個以上復孔，每孔總體積為200 μl。培養(yǎng)箱孵育72 h后取出，棄上清液控干水分，每孔加100 μl 4℃預冷的質(zhì)量分數(shù)為10%的三氯醋酸，靜置5 min后于4℃處避光保存1h以上;取出培養(yǎng)板用雙蒸水洗滌5遍，控干水分;每孔加入質(zhì)量分數(shù)為0.4%的SRB液50 μl靜置染色15 min;用質(zhì)量分數(shù)為1%的醋酸洗滌5遍，控干水分;每孔加入150 μl 10mmol·L－1Tris溶液，靜置5 min，于振蕩器上振蕩使之完全溶解。用酶標儀在570 nm波長處測定吸光度值(A)。按以下公式測得存在不同藥物濃度時細胞的增殖抑制率:抑制率/%=(1－藥物干預組A570/空白對照組A570)× 100%，取各復孔平均值，計算各組的增殖抑制率;實驗重復3次。

1.4 集落形成實驗檢測CUS與GEF聯(lián)合應用對BxPC-3細胞集落形成率的影響 消化BxPC-3細胞(臺盼藍染色法計算活細胞數(shù)達98%上)，制備成單細胞懸液，以每孔300個細胞的濃度接種于24孔板內(nèi)，置培養(yǎng)箱內(nèi)24 h待細胞貼壁后加藥。實驗設CUS干預組、GEF干預組、聯(lián)合用藥組和陰性對照組:CUS干預組藥物終濃度為0.03125及0.0625 μmol·L－1，GEF干預組藥物終濃度為2、4及8 μmol·L－1，聯(lián)合用藥組為上述兩組藥物各濃度的兩兩組合，陰性對照組未加入藥物;每組均設4個復孔，每孔總體積為1 000 μl。置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)14 d在倒置顯微鏡下觀察可見細胞克隆團形成，多數(shù)克隆團含50個細胞以上即可取出，棄上清，4℃預冷的PBS洗滌2次，加吉姆薩染液3～4滴覆蓋住細胞層染色5 min，用清水洗凈，自然干燥后顯微鏡下計數(shù)，取各復孔平均值，按如下公式計算集落抑制率:集落抑制率/%=(1－藥物干預組集落形成率/陰性對照組集落形成率)×100%;實驗重復3次。

1.5 Western blot檢測CUS與GEF聯(lián)合應用對BxPC-3細胞EGFR蛋白表達的影響 取BxPC-3細胞經(jīng)消化制備成單細胞懸液，以每皿200萬個細胞的濃度接種于直徑10 cm的培養(yǎng)皿中內(nèi)，置培養(yǎng)箱內(nèi)24 h待細胞貼壁后加藥。分別設置陰性組、CUS(0.25 μmol·L－1)、GEF(8 μmol·L－1)和CUS (0.25 μmol·L－1)聯(lián)合GEF(8 μmol·L－1)3個干預組及陰性對照組。置溫箱培養(yǎng)72 h后取出，棄上清，4℃預冷的PBS洗滌2次，細胞裂解液(50 mmol ·L－1Tris-HCl pH 7.5，0.15 mol·L－1NaCl，1% Na-deoxyoholale，1 mmol·L－1EDTA，1%Triton X-100，0.1%SDS，1 mmol·L－1PMSF)裂解細胞，提取細胞總蛋白并行BCA定量。蛋白變性后以100 μg·20 μl－1上樣行SDS-PAGE電泳，后250 mA恒電流75 min轉(zhuǎn)至PVDF膜，用質(zhì)量分數(shù)為3%的BSA封閉4 h，一抗(1∶1 000 EGFR、1∶1 000 Actin)4℃孵育過夜，洗膜后二抗室溫孵育1 h，再洗膜，常規(guī)暗室內(nèi)ECL顯色、曝光、顯影、定影，結(jié)果掃描并由Quantity One 4.62軟件分析，得到各組EGFR和內(nèi)參(Actin)條帶的灰度值，以陰性對照組為1，求得各組EGFR和內(nèi)參灰度值的相應比值;實驗重復3次。

2 結(jié)果

2.1 CUS與GEF聯(lián)合應用對人胰腺癌BxPC-3細胞的增殖抑制作用 SRB結(jié)果顯示，單用 CUS (0.0078125、0.015625、0.03125、0.0625、0.125及0.25 μmol·L－1)干預BxPC-3細胞72h對其抑制率分別為0.83%、3.72%、4.88%、14.40%、31.78%和44.49%，單用GEF(2、4、8及16 μmol·L－1)干預其抑制率分別為 27.16%、34.24%、50.18% 和66.42%，而相同條件下各濃度的CUS和GEF兩兩組合聯(lián)用的抑制率均大于藥物相應濃度單用的抑制率，計算得q＞0.85(Tab 1)，提示CUS聯(lián)合GEF呈相加作用，初步可見CUS與GEF聯(lián)合應用作用優(yōu)于單藥作用，而且在較大濃度范圍內(nèi)均有相加作用。

Tab 1 Proliferation inhibition of CUS combined with GEF in BxPC-3 cells(±s，n=4)

Tab 1 Proliferation inhibition of CUS combined with GEF in BxPC-3 cells(±s，n=4)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs the same concentration of GEF alone; IR:Inhibition rate

CUS/ μmol·L－1 GEF/ μmol·L－1 IR/% q valueSynergistic grade 0 0 0 0 0.99 + 2 27.16±1.52 0 4 34.24±2.54 0 8 50.18±1.67 0 16 66.42±0.49 0.0078125 0 0.30±0.03 0.0078125 2 27.74±1.16 1.01 + 0.0078125 4 36.04±0.80 1.05 + 0.0078125 8 50.85±2.10 1.01 + 0.0078125 16 68.12±0.47* 1.02 + 0.015625 0 3.72±1.78 + 0.015625 2 29.69±2.23 0.99 + 0.015625 4 38.00±2.09 1.04 + 0.015625 8 50.88±2.66 0.98 + 0.015625 16 70.29±2.98* 1.04 + 0.03125 0 4.88±1.51 + 0.03125 2 31.21±1.71* 1.02 + 0.03125 4 39.52±0.80* 1.06 + 0.03125 8 52.95±1.10* 1.01 + 0.03125 16 70.29±0.64＊＊ 1.03 + 0.0625 0 14.40±3.43 + 0.0625 2 38.46±1.32＊＊ 1.02 + 0.0625 4 43.63±1.29＊＊ 1.00 + 0.0625 8 54.03±1.25* 0.94 + 0.0625 16 72.30±1.91* 1.01 + 0.125 0 31.78±1.66 + 0.125 2 44.07±0.74＊＊ 0.88 + 0.125 4 49.24±0.25＊＊ 0.90 + 0.125 8 58.19±0.69＊＊ 0.89 + 0.125 16 77.26±3.85* 1.00 + 0.25 0 47.10±0.56 + 0.25 2 55.56±0.77＊＊ 0.90 + 0.25 4 58.80±1.38＊＊ 0.90 + 0.25 8 63.68±1.37＊＊ 0.86 + 0.25 16 81.38±1.42＊＊

2.2 CUS與GEF聯(lián)合應用對BxPC-3細胞集落形成的抑制作用 單用0.03125和0.0625 μmol·L－1CUS干預BxPC-3細胞時其集落形成抑制率分別為23.93%和29.45%，而單用2、4及8 μmol·L－1GEF時集落形成抑制率分別為13.50%、24.54%和36.81%;各濃度CUS聯(lián)合GEF應用時的集落形成抑制率均分別大于各藥單用時的抑制率，按金氏公式計算得到q＞1.15，協(xié)同效果為增強(Tab 2)。

Tab 2 Colony formation rates of BxPC-3 cells after intervention of CUS combined with GEF(±s，n=4)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs the same concentration of GEF;IR:Inhibition rate

CUS/ μmol·L－1 GEF/ μmol·L－1 Colony formation IR/% q valueSynergistic grade 0 0 0 0 1.31 ++ 2 13.50±3.87 0 4 24.54±2.94 0 8 36.81±6.07 0.00391 0 23.93±4.05 0.00391 2 41.72±3.50＊＊ 1.22 ++ 0.00391 4 50.92±9.20* 1.20 ++ 0.00391 8 60.74±2.02＊＊ 1.17 ++ 0.0078125 0 29.45±6.63 0.0078125 2 46.01±4.79＊＊ 1.18 ++ 0.0078125 4 55.83±7.73＊＊1.19 ++ 0.0078125 8 72.39±6.26＊＊

2.3 Western blot檢測CUS聯(lián)用GEF對人胰腺癌BxPC-3細胞EGFR蛋白表達水平的影響 結(jié)果如Fig 1所示，GEF(8 μmol·L－1)對BxPC-3細胞EGFR蛋白表達量沒有明顯影響，CUS組(0.25 μmol·L－1)BxPC-3細胞的EGFR蛋白表達量已有明顯減少，而CUS(0.25 μmol·L－1)聯(lián)合GEF(8 μmol·L－1)干預組BxPC-3細胞的EGFR蛋白表達量減少則更為明顯。從各組EGFR和內(nèi)參(Actin)條帶的灰度值比值，用金氏公式計算得 q值為2.06，說明 CUS聯(lián)合 GEF對胰腺癌BxPC-3細胞EGFR蛋白表達的抑制具有明顯增強的協(xié)同效果。

3 討論

以EGFR為靶點的腫瘤治療，主要為抗EGFR的靶向治療藥物，如單克隆抗體、酪氨酸激酶抑制劑等，目前已有10種以上的EGFR靶向藥物，在針對人類不同癌癥類型的治療方面，已取得了巨大的臨床進展。其中，兩種抗EGFR單克隆抗體(西妥昔單抗和帕尼單抗)以及兩種小分子可逆性EGFR酪氨酸激酶抑制劑(厄洛替尼和吉非替尼)，在一些國家已被批準用于治療轉(zhuǎn)移性非小細胞肺癌、頭頸部鱗狀細胞癌、結(jié)腸癌和胰腺癌［20－21］。但靶向治療藥物在臨床的應用中也存在不足之處，一些研究表明EGFR靶向化療藥物僅能抑制EGFR的酪氨酸激酶活性但不能下調(diào)其蛋白表達的水平，具有臨床應用單藥療效不佳及易產(chǎn)生耐藥性等特點。本課題組已經(jīng)證實了CUS是通過干擾胰腺癌中高表達EGFR的蛋白質(zhì)翻譯階段而起作用，而EGFR酪氨酸激酶抑制劑則能特異地抑制EGFR的功能。因此本研究我們將探討CUS與EGFR酪氨酸激酶抑制劑聯(lián)合作用于人胰腺癌細胞是否能進一步抑制細胞的增殖從而表現(xiàn)出協(xié)同抗胰腺癌作用。

Fig 1 EGFR protein level of BxPC-3 cells after intervention of CUS combined with GEF analyzed by Western blot(±s，n=3)

本課題組經(jīng)前期試驗發(fā)現(xiàn)吉非替尼(GEF)較厄洛替尼具有更良好的溶解性及藥物敏感性(IC50GEF=11.2，IC50ER=29.7，P＜0.05)，故選用GEF作為細胞靶向干預的試驗用藥。為了說明聯(lián)合用藥的效果，我們采用了一些經(jīng)典的實驗方法來求證。SRB法中選擇單用CUS和單用GEF以及兩藥聯(lián)用，觀察聯(lián)合用藥組對BxPC-3細胞生長的影響。結(jié)果顯示，與單藥作用相比，聯(lián)合的各組抑制率均明顯提高。CUS聯(lián)合GEF對BxPC-3細胞的作用效果以相加為主，相比之下低濃度藥物聯(lián)合組的q值相對較高，提示低濃度的藥物更適于聯(lián)用。以上結(jié)果表明低劑量范圍的CUS與GEF聯(lián)合是最佳的協(xié)同抑制濃度，提示聯(lián)用CUS可在提高療效的同時降低GEF的用藥劑量，從而降低GEF近期和遠期的不良反應，對改善預后有著特別重要的意義。另外，我們采用了集落形成實驗檢測CUS與GEF聯(lián)用的長期效果，計算集落個數(shù)能更直觀地了解BxPC-3細胞的生長情況。結(jié)果顯示各濃度的CUS聯(lián)合GEF應用時的集落形成抑制率均分別大于兩藥單用時的抑制率，按金氏公式計算得到q＞1.15，呈協(xié)同作用。本實驗說明隨著作用時間的延長，CUS與GEF聯(lián)用的協(xié)同效果更為明顯，提示該兩藥聯(lián)合的化療方案具有潛在的臨床應用價值。從Western blot的實驗結(jié)果可以看出:CUS(1 μmol·L－1)具有明顯下調(diào)BxPC-3細胞EGFR蛋白表達量的作用，這與我們前期的研究結(jié)果相吻合［18］;GEF(8 μmol·L－1)下調(diào)BxPC-3細胞EGFR蛋白水平不明顯，也證實了GEF僅能抑制EGFR的酪氨酸激酶活性但不能下調(diào)其蛋白表達的水平;而CUS(0.25 μmol·L－1)聯(lián)合應用GEF(8 μmol·L－1)則表現(xiàn)出了對BxPC-3細胞EGFR蛋白水平更為明顯的下調(diào)作用，說明吉非替尼可促進CUS下調(diào)BxPC-3細胞EGFR蛋白的表達，兩者具有明顯增強的協(xié)同作用(q＞2.0)。

綜上，本研究證實了CUS聯(lián)合GEF具有協(xié)同抑制胰腺癌細胞生長(低濃度和長時間作用協(xié)同效果尤為明顯)及協(xié)同下調(diào)EGFR蛋白的作用。兩者聯(lián)合應用，可分別從蛋白表達水平和蛋白酪氨酸激酶活性兩方面雙重抑制EGFR蛋白，應是兩者具有協(xié)同抗胰腺癌作用的重要機制之一。這也為胰腺癌的EGFR的靶向治療提供一個新的思路。

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