劉躍亮，羅進(jìn)勇，張 彥，何通川，曾照芳

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶，400016; 2.美國(guó)芝加哥大學(xué)醫(yī)學(xué)中心分子腫瘤學(xué)研究室，芝加哥 60637)

骨肉瘤是兒童和青少年最常見(jiàn)的原發(fā)惡性骨腫瘤之一，具有高惡性、早轉(zhuǎn)移、預(yù)后差、生存率低等特點(diǎn)。雖然，近年來(lái)輔助化療和新輔助化療的廣泛開(kāi)展與應(yīng)用，大為改善患者生存率，但是，現(xiàn)有化療藥物毒副作用大，而且，長(zhǎng)時(shí)間住院治療給患者帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，往往不能使患者堅(jiān)持化療而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生早轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)，甚至被迫截肢，治療效率得不到提高，這越來(lái)越引起臨床醫(yī)生的關(guān)注和腫瘤研究者的重視。因此，研究新型的、高效低毒的抗人骨肉瘤藥，成為骨肉瘤治療研究的重點(diǎn)。

青篙素是我國(guó)學(xué)者從中藥青篙中提取的含有過(guò)氧基團(tuán)的倍半萜內(nèi)酯(藥用植物的生物活性組分)藥物。而雙氫青蒿素為青蒿素的衍生物之一，由青蒿素經(jīng)四氫硼鈉還原而成，分子式為C15H24O5，分子質(zhì)量為284.35 ku，是青蒿素類藥物在體內(nèi)的主要的活性形式之一。很多文獻(xiàn)研究表明，雙氫青蒿素及其他衍生物除具有抗瘧作用外，還可有效減輕狼瘡腎炎動(dòng)物模型的病理?yè)p害［1］，此外，DHA也具有良好的抑制肺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌細(xì)胞、卵巢癌等的增殖和促進(jìn)其凋亡的作用［2～6］，具有明顯的腫瘤殺傷作用。新藥的多方面應(yīng)用成為新藥研究的新思路。但是，DHA在抗骨肉瘤方面的研究甚少。本研究就雙氫青蒿素對(duì)人骨肉細(xì)胞的作用以及可能的作用機(jī)制進(jìn)行探討，為雙氫青蒿素應(yīng)用于人骨肉瘤治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 設(shè)備 化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(BIO-RAD，ChemiDoc XRS+，bio-rad laboratories，Inc)，凝膠成像分析系統(tǒng)(BIO-RAD，bio-rad laboratories，Inc)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及試劑 人骨肉瘤細(xì)胞購(gòu)自ATCC (American type culture collection)。細(xì)胞培養(yǎng)用DMEM培養(yǎng)基含10%的胎牛血清和1%青、鏈霉素(P/S)，培養(yǎng)條件為5%CO2和37℃。噻唑鹽MTT、二甲基亞砜(DMSO)和胰蛋白酶/EDTA溶液均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。雙氫青蒿素購(gòu)自四川三奇制藥有限責(zé)任公司，用DMSO溶解并配制為70 mmol·L－1藥液，備用。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FCS)、青霉素/鏈霉素(P/S)購(gòu)自美國(guó)Thermo scientific公司。Hoechst 33258(C1011)購(gòu)自Beyotime。β-Catenin熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，由美國(guó)芝加哥大學(xué)醫(yī)學(xué)中心分子腫瘤學(xué)實(shí)驗(yàn)室，何通川教授惠贈(zèng)。Lipofectamine2000 (Cat.No.11668-02)購(gòu)自Inveitrogen。熒光素酶檢測(cè)試劑購(gòu)自Promega公司。BCA試劑盒，購(gòu)自Thermo Scientific。以下抗體均購(gòu)自Santa Cruze Biotechnology公司:mouse monoclonal antibody Bad(C-7):sc-8044;mouse monoclonal antibody Bcl-2(c-2):sc-7382;mouse monoclonal antibody Caspase-3(46):sc-136219;rabbit polyclonal antibody PCNA(FL-261): sc-7907。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分為Control(空白對(duì)照)、DMSO(溶劑對(duì)照)、15、25、35 μmol ·L－1DHA 5組。

1.3.2 MTT試驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的單層貼壁細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞，制備成約為5×106個(gè)·L－1的細(xì)胞懸液，在96孔板中，每孔加入100 μl細(xì)胞懸液，待細(xì)胞貼壁后，按照預(yù)定的實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理(每組進(jìn)行8個(gè)復(fù)孔)，處理結(jié)束前4 h，每孔加入 MTT(5 g·L－1) 0.02 ml，4 h后，在492 nm處進(jìn)行吸光度(OD值)測(cè)定，并繪制細(xì)胞存活圖。此實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3 克隆形成試驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的單層貼壁細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞，制備成細(xì)胞密度約為150個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，6孔板，每孔加入1 ml細(xì)胞懸液，待細(xì)胞貼壁后，按照預(yù)定的實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理，置37℃，5%CO2及飽和濕度環(huán)境下，靜置培養(yǎng)，在d 10終止培養(yǎng)，棄去上清液，用PBS小心漂洗2次。固定(固定液為1∶3醋酸/甲醇)15 min，然后進(jìn)行結(jié)晶紫活細(xì)胞染色30 min，用細(xì)流水緩慢漂洗去除染色液，自然風(fēng)干。觀察細(xì)胞克隆形成，在顯微鏡(低倍鏡)計(jì)數(shù)大于10個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)，進(jìn)行克隆形成計(jì)數(shù)并計(jì)算克隆形成率。此實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次?？寺⌒纬陕?%=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3.4 Hoechst 33258染色 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的單層貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞，制備成細(xì)胞密度約為5×107個(gè)·L－1的細(xì)胞懸液，24孔板，每孔加入0.5 ml細(xì)胞懸液，待細(xì)胞貼壁后，按照預(yù)定的實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理。待處理時(shí)間結(jié)束，加入Hoechst 33258溶液(1 g·L－1)，37℃水溶7 min，冰上冷卻，離心棄染液，PBS重懸，在紫外450 nm處觀察藍(lán)色熒光。正常對(duì)照細(xì)胞和壞死細(xì)胞呈弱藍(lán)色，凋亡細(xì)胞呈高亮藍(lán)色且觀察到核固縮。此實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5 螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒試驗(yàn) 將指數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)的細(xì)胞鋪于24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染0.3 μg報(bào)告質(zhì)粒，5 h后終止轉(zhuǎn)染并更換為正常培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)分組處理，24 h后裂解細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行螢光素酶活性測(cè)定。BCA法測(cè)定裂解液總蛋白濃度，校正螢光素酶活性。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.3.6 Western blot 人骨肉瘤143B細(xì)胞在DHA處理24 h后，使用碧云天WESTERN BLOT細(xì)胞裂解液(按說(shuō)明書(shū)操作)，收集蛋白樣品(Protein sample preparation)，在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。沸水浴10 min，使蛋白質(zhì)充分變性，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。此實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用IBM SPSS Statistics 19軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，不同組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 DHA抑制骨肉瘤細(xì)胞143B增殖

2.1.1 DHA明顯地抑制143B細(xì)胞增殖活性和存活率(MTT比色法和結(jié)晶紫染色法) 不同濃度的DHA作用于人骨肉瘤143B細(xì)胞，24 h后，MTT比色法結(jié)果如Fig 1A所示，試驗(yàn)組較對(duì)照組，細(xì)胞增殖活性明顯降低，且表現(xiàn)出濃度和時(shí)間依賴的的抑制效果。結(jié)晶紫染色結(jié)果如Fig 1B所示，處理組較對(duì)照組，細(xì)胞數(shù)明顯減少，DHA濃度達(dá)到35 μmol· L－1時(shí)，效果最為明顯。

Fig 1 Inhibitory effect of DHA on 143B osteasarcoma cell lines(±s，n=3)

2.1.2 DHA有效地減弱143B細(xì)胞克隆形成能力

DHA在明顯抑制143B細(xì)胞增殖活性的同時(shí)，也抑制其克隆形成能力，如Fig 2克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果所示，各實(shí)驗(yàn)分組克隆形成率分別為0.607、0.580、0.453、0.313、0.253。

Fig 2 Effect of clone formation after DHA played role in 143B osteosarcoma cells

2.1.3 DHA抑制了細(xì)胞增殖蛋白PCNA表達(dá) 為了進(jìn)一步說(shuō)明DHA具有抑制人骨肉瘤細(xì)胞143B增殖的能力，研究中檢測(cè)了增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)，DHA作用人骨肉瘤細(xì)胞143B，24 h后，Western blot檢測(cè)結(jié)果(如Fig 4)顯示PCNA蛋白表達(dá)減少，不能正常的發(fā)揮DNA聚合酶δ的輔助蛋白［7］的作用，使143B細(xì)胞DNA合成受限制，從而抑制其增殖。

Fig 3 Activity of β-Catenin inhibited by DHA after its role in 143B cell lines

2.1.4 DHA抑制了Wnt-β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中關(guān)鍵蛋白因子β-Catenin活性 因?yàn)閃nt-β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常與人類疾病密切相關(guān)，尤其是腫瘤方面。因此，研究中構(gòu)建了β-Catenin熒光素酶質(zhì)粒(p-Top)，腺病毒介導(dǎo)的Wnt-3a過(guò)表達(dá)(陽(yáng)性對(duì)照)，結(jié)果顯示，如Fig 3，Adv-Wnt-3a可有效刺激β-Catenin活性，而實(shí)驗(yàn)組只有很微弱的β-Catenin活性，表明DHA抑制了Wnt-β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中關(guān)鍵蛋白因子β-Catenin的活性。

Fig 4 Decreased expression of PCNA protein induced by DHA in 143B cell lines

2.2 DHA誘導(dǎo)人骨肉瘤細(xì)胞143B凋亡

2.2.1 DHA促進(jìn)143B細(xì)胞凋亡(Hoechst 33258細(xì)胞凋亡染色法) Hoechst33258細(xì)胞凋亡染色結(jié)果，如Fig 5所示，DHA作用于143B細(xì)胞24 h后，對(duì)照組，細(xì)胞形態(tài)完整、核大小一致、熒光分布均勻且呈彌散狀，顯示微弱藍(lán)色，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組，細(xì)胞核表現(xiàn)為明顯的核縮小、染色質(zhì)濃集，熒光著色不均勻，呈現(xiàn)細(xì)胞凋亡核形態(tài)，表明DHA具有誘導(dǎo)人骨內(nèi)瘤細(xì)胞143B凋亡的作用。

Fig 5 Apoptosis of 143B osteosarcoma cell lines induced by DHA in Hoechst 33258 dye，and concentration-dependently

2.2.2 DHA使凋亡相關(guān)蛋白發(fā)生明顯改變 通過(guò)檢測(cè)與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的Bcl-2家族成員［8］，Bcl-2和Bad，以及執(zhí)行細(xì)胞凋亡的蛋白因子Caspase-3［9］，在蛋白質(zhì)水平上，進(jìn)一步研究DHA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制。Western blot結(jié)果，如Fig 6所示，Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，而B(niǎo)ad蛋白表達(dá)上調(diào)，增加了Bad與Bcl-2結(jié)合［10］，從而抑制Bcl-2的抗凋亡活性，同時(shí)Caspase-3表達(dá)增高，表明其促凋亡功能被增強(qiáng)。所以，Western bolt結(jié)果提示DHA可有效地促進(jìn) 143B細(xì)胞凋亡，可能是通過(guò)上調(diào) Bad和Caspase-3蛋白，增加其促凋亡功能，并減弱Bcl-2蛋白的抗凋亡活性來(lái)發(fā)揮作用。

3 討論

雙氫青蒿素及其他衍生物，是一類藥效明顯、治愈率高、毒副作用和耐藥性發(fā)生極低的抗瘧藥物，尤其對(duì)耐氯喹或?qū)Χ喾N藥物耐藥的腦型瘧和惡性瘧有效［11］，因此，被廣泛應(yīng)用于臨床，還被WHO批準(zhǔn)為抗瘧一線藥物。雙氫青蒿素與青蒿素相比，水溶性較強(qiáng)，更易吸收，排泄和代謝迅速、高效、低毒等優(yōu)點(diǎn)。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)雙氫青蒿素除了特異地抗瘧作用外，還具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抑制瘢痕增生及抗腫瘤作用，尤其在抗腫瘤方面，抗腫瘤活性強(qiáng)，而對(duì)正常組織細(xì)胞的毒性很低，因此被廣泛關(guān)注。本研究中，采用不同濃度的雙氫青蒿素(DHA)體外作用于人骨肉瘤細(xì)胞株143B，通過(guò)MTT比色法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)(見(jiàn)Fig 1)，不同濃度的DHA可以抑制骨肉瘤細(xì)胞143B的增殖，而且抑制率與DHA的濃度和時(shí)間存在依賴關(guān)系，當(dāng)DHA濃度達(dá)到35 μmol ·L－1，作用48 h后，與對(duì)照組相比，抑制增殖效果最為明顯，差異有顯著性(P＜0.01)，而且143B細(xì)胞的克隆形成能力也明顯受到抑制(見(jiàn)Fig 2)。

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，是多步驟、多階段、多因素共同參與的結(jié)果。其中增殖和凋亡失控是其生理功能上最大的改變，表現(xiàn)為過(guò)度增殖和凋亡抑制。因此，對(duì)增殖和凋亡的干預(yù)，成為腫瘤治療研究中的切入點(diǎn)。

細(xì)胞凋亡是有機(jī)體為保持自身組織穩(wěn)定、調(diào)控自身細(xì)胞的增殖和死亡之間的平衡、由基因控制的細(xì)胞主動(dòng)性死亡過(guò)程［12］。正常的細(xì)胞凋亡，受凋亡調(diào)節(jié)基因的嚴(yán)格調(diào)控，其中Bad和Bcl-2蛋白是重要的凋亡調(diào)節(jié)蛋白家族的重要成員，在組織中廣泛表達(dá)。Bcl-2通過(guò)C末端疏水性氨基酸錨定于線粒體外膜，而B(niǎo)ad則散布于基質(zhì)中，激活后移位至線粒體表面與Bcl-2作用，通過(guò)調(diào)控線粒體膜電位及通透性轉(zhuǎn)換通道，釋放線粒體膜間隙的促凋亡蛋白，如細(xì)胞色素C、Smac/DIABLO、AIF和endonuclease G(endoG)等，后者激活半胱氨酸蛋白酶(caspase)家族引發(fā)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)并最終引起膜泡形成，核碎裂和細(xì)胞凋亡［10］。細(xì)胞中Bcl-2與Bad之間的比例決定了細(xì)胞是否接受誘導(dǎo)凋亡的信號(hào)。在研究中發(fā)現(xiàn)，DHA可有效地抑制了Bcl-2的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)了Bad蛋白Caspase-3蛋白表達(dá)，如Fig 6，即，Bcl-2與Bad之間的比例已經(jīng)被破壞，高表達(dá)的Bad蛋白與Bcl-2結(jié)合增多，從而抑制了其抗凋亡作用，同時(shí)，通過(guò)高表達(dá)的Caspase-3，增強(qiáng)其凋亡執(zhí)行能力，而使143B細(xì)胞凋亡增加(見(jiàn)Fig 5)。

Fig 6 Change of protein expression after DHA's role in 143B osteosarcoma cell lines detected by Western blot

研究表明，Wnt-β-Ceatenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，無(wú)論在低等生物果蠅還是高等哺乳動(dòng)物，都表現(xiàn)出其在生物進(jìn)化中的保守性，使其成員都具有高度的同源性［13］。該信號(hào)通路異常與人類疾病密切相關(guān)，尤其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中。因此。對(duì)Wnt-β-Catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究，不僅有助于理解人類疾病(尤其是腫瘤)可能的發(fā)生機(jī)制，而且可以為疾病的治療提供一系列新的靶點(diǎn)。研究結(jié)果表明，DHA可以有效地降低β-Catenin的生物活性(Fig 3)，因此，在后期實(shí)驗(yàn)中，將重點(diǎn)對(duì)Wnt-β-Catenin信號(hào)通路進(jìn)行研究，包括β-Catenin降解復(fù)合物中糖原合成激酶3β(Gycogen synthesis kinase-3β，GSK-3β)及其磷酸化產(chǎn)物(GSK-3β通過(guò)磷酸化Ser33、Ser37和Thr41標(biāo)記蛋白)蛋白表達(dá)，磷酸化位點(diǎn)確認(rèn)，以及β-ceatenin的靶蛋白，如Cyclin D1、c-Myc等蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步對(duì)可能的作用機(jī)制進(jìn)行探討和研究，為雙氫青蒿素應(yīng)用于臨床，提供更有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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