馬艷華，蘇 波，向姝霖，姜 浩，楊邦敏，章 碩，夏 紅，蘇 琦

(南華大學(xué)1.附屬第一醫(yī)院，2.腫瘤研究所，湖南省高校腫瘤細(xì)胞與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南衡陽 421001)

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一。我國胃癌死亡率占惡性腫瘤死亡的23.2%，為歐美國家的4.2～8.0倍，患者就診時大多已經(jīng)發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，因而手術(shù)、化療、放療療效差，5年生存率低(發(fā)達(dá)國家33%，發(fā)展中國家20.5%)［1－2］。因此，開發(fā)有效、低毒的腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移抑制劑，對提高胃癌5年生存率具有重要的意義。

研究表明［3］，二烯丙基二硫(diallyl disulfide，DADS)是大蒜中的一種脂溶性有效成分，具有抑制多種惡性腫瘤細(xì)胞增殖的作用。本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)證明，DADS可在體內(nèi)外明顯誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞增殖抑制與分化，其機(jī)制與降低ALP比活性與Con A凝集率，增加與重組細(xì)胞骨架蛋白合成，恢復(fù)細(xì)胞間縫隙連接通訊功能，阻滯細(xì)胞于G2/M，調(diào)節(jié)ATR/Chk1/ Cdc25C/cyclin B1、激活p38、抑制ERK/AP-1，上調(diào)組蛋白乙?；21 WAF1等有關(guān)［4－8］。并且，我們在DADS抑制人胃癌細(xì)胞增殖的蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)LIMK1明顯下調(diào)［9］。本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，探討DADS對LIMK1表達(dá)在胃癌MGC803細(xì)胞遷移侵襲中的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 人胃癌MGC803細(xì)胞系南華大學(xué)腫瘤研究所保存。培養(yǎng)于10%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2的恒濕培養(yǎng)箱中，2 d傳代1次。

1.2 試劑與配制 DADS:Fluka公司產(chǎn)品，純度80%，與Tween80以1∶2的比例充分溶解，加入體積分?jǐn)?shù)為0.90的生理鹽水稀釋100倍，作為母液保存于－20℃冰箱中。小牛血清(杭州四季青生物工程公司)，RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco公司)，Total RNA Kit(Omega公司)，RT試劑盒(Invitrogen公司)，PCR試劑為Promega公司產(chǎn)品。BCA蛋白定量檢測試劑盒(Pierce公司)，ECL發(fā)光檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，胰蛋白酶Amresco公司產(chǎn)品，LIMK1(ab39641)rabbit polycloncial antibody、β-actin為美國ABCAM公司產(chǎn)品。

1.3 劃痕試驗(yàn) 將2×106個MGC803細(xì)胞接種在6孔板，培養(yǎng)至90%融合狀態(tài)，無血清培養(yǎng)液洗3次，加入新鮮無血清培養(yǎng)基;10 μl Eppendorf Tip在細(xì)胞板上劃痕，無血清培養(yǎng)液洗3次，加入新鮮無血清培養(yǎng)基;加入不同濃度DADS，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱，測量0 h、24 h的劃痕距離，計算平均值與標(biāo)準(zhǔn)差，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 采用孔徑8.0 μm的Transwell(3428型)(Corning公司)?；|(zhì)膠準(zhǔn)備:將凍存于－80℃冰箱的matrigel(BD公司)4℃過夜，變成液態(tài);無血清培養(yǎng)基以1∶9稀釋，吸50μl均勻鋪到Transwell上室，37℃過夜，當(dāng)出現(xiàn)“白色層”時，說明已經(jīng)變?yōu)楣虘B(tài)。在上室中加入100 μl預(yù)溫的無血清的DMEM培養(yǎng)基，室溫孵育30 min，使基質(zhì)膠再水化，吸去剩余培養(yǎng)液，消化細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基洗3次，調(diào)整細(xì)胞密度為1×109個·L－1;取細(xì)胞懸液100 μl加入上室，下室加入500 μl完全培養(yǎng)基;37℃、5%CO2孵育24 h，棄培養(yǎng)基，用棉簽輕輕擦拭上室細(xì)胞;取出Transwell用PBS洗2次，4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min，倒置，風(fēng)干;加入0.1%結(jié)晶紫染色20 min，PBS洗3次，棉簽擦凈上室細(xì)胞;倒置顯微鏡隨機(jī)計數(shù)10個視野的細(xì)胞數(shù)，取均數(shù)。每組細(xì)胞設(shè)3個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。侵襲抑制率/%=［(對照組穿膜細(xì)胞數(shù)－處理組穿膜細(xì)胞數(shù))/對照組穿膜細(xì)數(shù)］×100%。

1.5 RT-PCR Total RNA Kit提取細(xì)胞總RNA，在AMV酶作用下逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。設(shè)計并合成PCR引物序列:β-actin:F 5'-ACA CTG TGC CCA TCT ACG AGG GG-3'，R 5'-ATG ATG GAG TTG AAG GTA GTT TCG TGG AT-3'，擴(kuò)增片段367 bp; LIMK1:F5'-GGGGCATCATCAAGAGCA-3'，R5'-TGA GGGTGTTGACGGACC-5'，擴(kuò)增片段138 bp。LIMK1反應(yīng)條件:94℃5 min;94℃ 30 s，52.3℃ 30 s，72℃1 min，進(jìn)行35個循環(huán);72℃10 min。β-actin反應(yīng)條件:94℃ 5 min;94℃ 30 s，55.0℃ 30 s，72℃ 1 min，進(jìn)行35個循環(huán);72℃10 min。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)拍照，AlphaImager 2200軟件掃描，相對光密度(ROD)代表基因表達(dá)豐度，以LIMK1/β-actin表達(dá)豐度計算平均光密度值。

1.6 Western blot 分別收集細(xì)胞，冰PBS洗2次，1×107個細(xì)胞加入100～150 μl裂解液(100 mmol· L－1NaCl，10 mmol·L－1Tris-HCl pH 7.6，1 mmol· L－1EDTA pH 8.0，1 mg·L－1Aprotinin，100 mg· L－1PMSF)，冰上裂解1 h，12 000 r·min－1離心10 min，吸出上清液，即細(xì)胞總蛋白。Bradford法測定蛋白質(zhì)含量，分光光度計在570 nm波長處測定光吸收值，以溶劑為空白對照，牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)繪制曲線，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線推算蛋白質(zhì)含量。收集蛋白，變性后，10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，含5%牛血清白蛋白的TBST(Tris-HCl 20 mmol·L－1，NaCl 137 mmol·L－1含0.1%Tween-20)封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，TBST洗3次，每次5 min，二抗孵育1 h，TBST洗3次，每次5 min，化學(xué)發(fā)光劑檢測蛋白質(zhì)印跡，薄層掃描儀測定光密度值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件One-Way ANOVA或t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。

2 結(jié)果

2.1 DADS抑制人胃癌MGC803細(xì)胞增殖 Fig 1所示，30 mg·L－1DADS作用MGC803細(xì)胞24、48、72、96 h后，其抑制率分別為 31.8%、66.1%、83.6%與89.2%(P＜0.05)。表明DADS可呈時間依賴性明顯抑制人胃癌MGC803細(xì)胞增殖。

Fig 1 Effect of DADS on the proliferation of MGC803 cells *P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control

2.2 DADS對人胃癌MGC803細(xì)胞遷移能力的影響 Fig 2、3所示，DADS未處理與處理的MGC803細(xì)胞在0h劃痕距離較一致，10、20、30、40、50 mg· L－1DADS作用24 h后，細(xì)胞的劃痕距離明顯減少，表明MGC803細(xì)胞具有較強(qiáng)的遷移能力。而處理組較未處理組呈濃度依賴性劃痕距離明顯增加，表明DADS可抑制人胃癌MGC803細(xì)胞遷移。

2.3 DADS對人胃癌MGC803細(xì)胞侵襲能力的影響 Fig 4，5所示，10、20、30、40、50 mg·L－1DADS作用MGC803細(xì)胞24 h后，穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)分別為(35.8±3.74)、(34.1±2.02)、(31.7±4.81)、(17.2±3.08)、(13.2±3.36)個，明顯少于對照組細(xì)胞數(shù)(39.5±2.99)個(P＜0.05)。結(jié)果表明，DADS可濃度依賴性降低人胃癌MGC803細(xì)胞的體外侵襲能力。

Fig 2 Effect of DADS on the migration of MGC803 cells(×4)

Fig 3 Effect of DADS on the migration of MGC803 cells

Fig 4 Effect of DADS on the invasion of MGC803 cells(×200)

Fig 5 Effect of DADS on the invasion of MGC803 cells

2.4 DADS對人胃癌MGC803細(xì)胞LIMK1表達(dá)影響 RT-PCR顯示，30 mg·L－1DADS處理MGC803細(xì)胞48h后，LIMIK1 mRNA明顯下降(P＜0.05)(Fig 6)。表明DADS在mRNA水平上可以抑制LIMK1表達(dá)。

Fig 6 Effect of DADS on LIMK1 mRNA expression in MGC803 cells

Fig 7 Effect of DADS on the expression of LIMK1 in MGC803 cells by Western blot

3 討論

腫瘤細(xì)胞的遷移侵襲行為是發(fā)生轉(zhuǎn)移最關(guān)鍵的因素，明確腫瘤細(xì)胞的遷移侵襲機(jī)制，抑制腫瘤細(xì)胞的遷移侵襲能力已成為近年來研究的熱點(diǎn)。

本研究顯示，30 mg·L－1DADS作用MGC803細(xì)胞24、48、72、96 h后，其抑制率分別為31.8%、66.1%、83.6%與89.2%，表明DADS可呈時間依賴性抑制人胃癌MGC803細(xì)胞增殖(P＜0.05)。10、20、30、40、50 mg·L－1DADS作用24 h后，細(xì)胞的劃痕距離明顯減少，穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)明顯少于對照組(P＜0.05)，表明DADS可呈濃度依賴性降低MGC803細(xì)胞的遷移侵襲能力。

研究證明，LIMK1在多種惡性腫瘤細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)或活性增強(qiáng)，并通過不同機(jī)制和途徑參與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程。LIMK1基因位于人類染色體上7q11.23，全長39 499個 bp，編碼 LIMK1蛋白。LIMK1可磷酸化Cofilin/ADF蛋白第3位的絲氨酸，磷酸化后其解聚肌動蛋白的能力消失，肌動蛋白聚合形成偽足結(jié)構(gòu)，驅(qū)動腫瘤細(xì)胞遷移。因此，LIMK1對cofilin磷酸化與去磷酸化間的平衡進(jìn)行微調(diào)節(jié)可能是影響腫瘤細(xì)胞遷移侵襲能力的決定性因素［10］。LIMK1的活性受多種蛋白調(diào)控，調(diào)節(jié)其活性的上下游的信號分子單獨(dú)或聯(lián)合LIMK1參與腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移，主要受Rho-ROCK/PAK-LIMK-ADF/Cofilin信號通路調(diào)控。上調(diào)LIMK1活性的正調(diào)節(jié)蛋白包括Rac1、ROCK與PAK1、4，可使第508位的蘇氨酸殘基磷酸化而激活激酶［10－11］。許多癌基因通過調(diào)節(jié)LIMK的活性實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的遷移侵襲，如PKC zeta通過影響LIMK調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重組，促進(jìn)人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移。VEGF通過MAPK途徑調(diào)節(jié)LIMK1的活性，影響肌動蛋白重組及血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移［12］。此外，許多抑癌基因通過下調(diào)LIMK1發(fā)揮其抑癌活性。如p57通過控制LIMK1活性減少肌動蛋白周轉(zhuǎn)率，影響腫瘤細(xì)胞的遷移能力，發(fā)揮其抑癌作用［13］。近來，我們發(fā)現(xiàn)LIMK1在胃癌中表達(dá)明顯高于正常組織與非典型增生組織，并隨分化程度降低而增強(qiáng)，瘤體積≤3.0 cm的胃癌表達(dá)明顯低于＞3.0 cm，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯高于未轉(zhuǎn)移組，TNM分期Ⅰ、Ⅱ期表達(dá)明顯低于Ⅲ、Ⅳ期。提示LIMK1與胃癌的發(fā)生、分化程度、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及臨床分期密切相關(guān)［14］。并且證明DADS可抑制人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞遷移與侵襲，其機(jī)制與下調(diào)LIMK1有關(guān)［15］。

本研究RT-PCR顯示，30 mg·L－1DADS處理MGC803細(xì)胞48 h后，LIMIK1 mRNA明顯下降(P＜0.05)，表明 DADS在 mRNA水平上可抑制LIMK1表達(dá)。同樣，Western blot結(jié)果證明，LIMK1蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.05)，表明DADS可抑制MGC803細(xì)胞LIMK1蛋白表達(dá)。

綜上所述，DADS可明顯抑制人胃癌MGC803細(xì)胞遷移侵襲，可能與下調(diào)LIMK1表達(dá)有關(guān)。本研究為尋找抑制腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的作用靶點(diǎn)提供了依據(jù)。但 DADS是否通過 Rac1-Rock1/Pak1-LIMK1通路調(diào)控ADF/cofilin，抑制人胃癌細(xì)胞遷移與侵襲，其分子機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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