劉 玲，魯 茜，楊婷婷，張 帆，尹家樂(lè)，杜 蕾，印曉星

(徐州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院1.新藥與臨床應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室，2.臨床藥理學(xué)教研室，江蘇徐州 221000)

糖尿病是一種因體內(nèi)胰島素絕對(duì)或者相對(duì)不足而導(dǎo)致的一系列臨床綜合征。隨著人們生活方式改變、人口老齡化問(wèn)題日益加劇，糖尿病患者人數(shù)迅速增加。在我國(guó)，高達(dá)62.37%的2型糖尿病患者會(huì)出現(xiàn)不同程度的晶狀體混濁即糖尿病性白內(nèi)障(diabetic cataract，DC)，且發(fā)病率隨病程的延長(zhǎng)而明顯增加。DC的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，涉及多種因素，其中醛糖還原酶(aldose reductase，AR)的激活和表達(dá)上調(diào)，糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycosylation end products，AGEs)的大量積聚以及活性氧(reactive oxygen species，ROS)誘發(fā)的氧化應(yīng)激損傷等被認(rèn)為是DC發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［1-4］。

銀杏葉提取物(Ginkgo biloba extract，GBE)是采用現(xiàn)代提取技術(shù)從銀杏葉中提取的活性成分，其有效成分主要包括黃酮苷類(lèi)和萜類(lèi)［5］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，GBE可以通過(guò)其抗氧化作用及抑制AGEs、AR的作用，抑制高糖誘發(fā)的人晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡，這對(duì)于延緩糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)生具有極其重要的意義［6］。為進(jìn)一步驗(yàn)證GBE對(duì)DC的療效，并探索其防治DC的機(jī)制，我們?cè)阪滊迕顾?streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)的糖尿病性白內(nèi)障大鼠上觀察了GBE對(duì)其晶狀體混濁度、抗氧化指標(biāo)、糖基化終產(chǎn)物含量和醛糖還原酶表達(dá)的影響，以抗白內(nèi)障藥物芐達(dá)賴氨酸(bendazac lysine，BDL)作為陽(yáng)性對(duì)照藥，通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)明確GBE對(duì)DC的防治作用，并初步探討其作用機(jī)制，以期能為DC的防治尋找新的藥物，為增加GBE的臨床適應(yīng)癥提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康♂SD大鼠，體質(zhì)量150～190 g，經(jīng)散瞳后檢查晶狀體無(wú)異常，由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SYXK 2002-0038。

1.2 主要試劑 STZ，美國(guó)Calbiochem公司;GBE (含銀杏黃酮＞24%，萜類(lèi)＞6%)，邳州富偉生化有限公司;芐達(dá)賴氨酸，浙江平湖莎普愛(ài)恩制藥有限公司;大鼠AGEs酶聯(lián)免疫試劑盒，美國(guó)R＆D公司;羊抗AR多克隆抗體，美國(guó)Santa Cruz公司;兔抗β-Tubulin抗體美國(guó)Bioworld公司;T-SOD試劑盒、CAT可見(jiàn)光試劑盒、GSH試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組及模型制備 SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照(NS)組(8只)和糖尿病造模組(50只)。禁食24 h后，腹腔一次性注射STZ 65 mg·kg-1，NS注射等量檸檬酸鈉緩沖液(pH=4.4)。72 h后尾靜脈取血，測(cè)定空腹血糖≥13.88 mmol·L-1者為造模成功。將造模成功的SD大鼠隨機(jī)分為5組:DC模型組(DC)、GBE低劑量治療組(GL)、GBE中劑量治療組(GM)、GBE高劑量治療組(GH)、芐達(dá)賴氨酸(BDL)對(duì)照組，各組8只。各組成模當(dāng)日作為實(shí)驗(yàn)d 1，低中高GBE治療組劑量分別為50、100、200 mg·kg-1，BDL組的劑量為200 mg·kg-1，均以1 %羧甲基纖維素配成不同濃度的混懸液灌胃給藥，每天1次，NS組、DC模型組均給予同體積的1%羧甲基纖維素。所有動(dòng)物在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間均喂標(biāo)準(zhǔn)飲食，自由飲水，不應(yīng)用其它藥物。

1.3.2 樣本收集 給藥12周后，測(cè)定各組大鼠血糖水平，稱(chēng)重麻醉后迅速摘除雙眼眼球，顯微鏡下分離晶狀體，仔細(xì)剔除晶狀體上附著的虹膜及懸韌帶，稱(chēng)重標(biāo)記，-80℃冰箱保存待用。

1.3.3 晶狀體混濁度的分級(jí) 1%托品酰胺滴眼液點(diǎn)大鼠雙眼1次，5min后使用裂隙燈觀察晶狀體變化，觀察和記錄大鼠晶狀體形態(tài)的改變，并將晶體混濁程度參照Azuma等［7］的標(biāo)準(zhǔn)分為5級(jí):Ⅰ級(jí):無(wú)混濁，晶體透明;Ⅱ級(jí):輕度混濁，晶體周邊出現(xiàn)空泡;Ⅲ級(jí):中度混濁，晶體周邊空泡向中心擴(kuò)展，核出現(xiàn)霧狀混濁;Ⅳ級(jí):高度混濁，晶體周邊空泡擴(kuò)展到核區(qū)，核霧狀混濁加重;Ⅴ級(jí):核混濁，白內(nèi)障成熟。

1.3.4 抗氧化指標(biāo)的測(cè)定 每組各取6個(gè)晶狀體制備晶狀體勻漿液。將低溫保存的晶狀體標(biāo)本吸干水分后，按重量體積比加入預(yù)冷的生理鹽水制備成10%的組織勻漿，4 000 r·min-1，低溫離心 10 min，取上清，分裝待測(cè)。參照試劑盒說(shuō)明測(cè)定CAT、GSH、T-SOD水平。

1.3.5 糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)含量測(cè)定 取大鼠晶狀體勻漿液，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定樣品中大鼠晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)的水平，具體操作參照試劑盒說(shuō)明。

1.3.6 免疫印跡測(cè)定醛糖還原酶(AR)相對(duì)表達(dá)量采用BCA法測(cè)定樣品蛋白濃度。將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度，充分混合沉淀后加樣緩沖液后按50 μg/孔上樣，經(jīng)10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，以半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。室溫封閉3 h后加入按1∶200濃度稀釋的羊抗AR多克隆抗體，4℃過(guò)夜。用洗滌液洗膜，加入相應(yīng)的二抗(驢抗山羊Ig-AP)，室溫孵育2 h。洗膜3次，以硝基藍(lán)四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸(NBT/BCIP)顯色，水洗終止反應(yīng)。β-tubulin以相同方法檢測(cè)。結(jié)果以Image J圖像軟件分析處理，測(cè)定條帶灰度值，蛋白表達(dá)的變化以實(shí)驗(yàn)組中相應(yīng)條帶的灰度值相對(duì)于β-tubulin的倍數(shù)表示。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 各組數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，兩組間比較采用q檢驗(yàn)。等級(jí)資料用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)大鼠生理情況的影響 正常組大鼠活動(dòng)頻繁、毛發(fā)光澤、飲水量正常、尿量正常。DC組大鼠活動(dòng)度低、眼球蒼白、毛發(fā)枯黃無(wú)色澤、豎毛弓背、飲水量高、尿量多。GBE中、高劑量治療組大鼠“三多一少”癥狀有所緩解，而飲水量和尿量仍然較高，墊料較潮。GBE低中高劑量組大鼠空腹血糖有一定程度的降低，但仍處于高血糖水平，與DC組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Tab 1)。

Tab 1 Effects of GBE on fasting blood glucose in diabetic rats(mmol·L-1，±s，n=6)

Tab 1 Effects of GBE on fasting blood glucose in diabetic rats(mmol·L-1，±s，n=6)

##P＜0.01 vs NS group

Group 0 wk 12 wk NS 5.98±0.72 5.77±1.02 DC 26.34±3.15## 27.91±3.40## GL 25.66±2.71 25.07±2.87 GM 27.37±2.09 25.31±2.18 GH 26.31±2.43 24.10±2.33 BDL 25.15±3.06 24.01±2.97

2.2 GBE對(duì)晶狀體混濁度的影響 經(jīng)裂隙燈顯微鏡檢查，正常對(duì)照組大鼠晶狀體透明，無(wú)混濁發(fā)生。DC組大鼠晶狀體混濁度明顯高于正常對(duì)照組，出現(xiàn)霧狀混濁、核混濁，多為Ⅲ～Ⅴ級(jí)。GBE中、高劑量組與DC組相比，大鼠晶狀體混濁度有所減輕，其混濁度等級(jí)差異有顯著性(P＜0.05或P＜0.01)，提示GBE可降低DC大鼠晶狀體混濁度，對(duì)DC大鼠晶狀體出現(xiàn)混濁具有一定的抑制作用。BDL組晶狀體混濁度等級(jí)與DC組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Tab 2)。

Tab 2 Effects of GBE on grading of lens opacification of rats(n=12)

Fig 1 Effect of GBE on cataractogenesis of rats

2.3 GBE對(duì)氧化應(yīng)激的影響 與正常組相比，DC組大鼠晶狀體組織中T-SOD活性，CAT活性和GSH含量明顯降低(P＜0.01)，表明其抗氧化能力下降。與DC組相比，GBE高劑量治療組的T-SOD活性，CAT活性和GSH含量升高(P＜0.01)，GBE中劑量組的各項(xiàng)指標(biāo)也有升高(P＜0.05)。BDL組T-SOD活性升高(P＜0.05)，GSH含量與CAT酶活力水平無(wú)明顯變化(Tab 3)，此結(jié)果表明GBE能明顯改善DC大鼠晶狀體的氧化應(yīng)激狀態(tài)，且在抗氧化作用方面較BDL更強(qiáng)。

Tab 3 Effects of GBE on the activities of the CAT，T-SOD and the level of GSH of lens in diabetic rats(±s，n=6)

Tab 3 Effects of GBE on the activities of the CAT，T-SOD and the level of GSH of lens in diabetic rats(±s，n=6)

##P＜0.01 vs NS group;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs DC group

Group T-SOD/ U·mg-1Pro GSH/ mg· g-1Pro CAT/ U·mg-1Pro NS 23.95±1.89 4.79±0.69 4.07±0.26 DC 9.10±1.58## 1.67±0.44## 2.44±0.30## GL 11.28±2.05 2.05±0.22 2.68±0.33 GM 12.76±1.63* 2.54±0.50＊＊ 2.82±0.37 GH 16.97±2.88＊＊ 2.82±0.37＊＊ 2.98±0.31＊＊BDL 12.72±3.11*2.20±0.70 2.62±0.38

2.4 GBE對(duì)AGEs含量的影響 與正常組相比，DC組大鼠晶狀體組織中的AGEs相對(duì)含量明顯升高(P＜0.01)。與DC組相比，GBE高劑量治療組的AGEs明顯下降(P＜0.05)。BDL組大鼠晶狀體組織中AGEs含量無(wú)明顯降低(Tab 4)，提示GBE能夠抑制DC大鼠晶狀體AGEs的生成。

2.5 GBE對(duì)AR表達(dá)水平的影響 DC組大鼠晶狀體組織中AR的相對(duì)表達(dá)量與正常組相比明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。GBE高劑量治療組的AR表達(dá)水平與DC組相比皆有明顯降低(P＜0.01)。BDL治療組的AR表達(dá)水平與DC對(duì)照組相比差異也有顯著性(P＜0.01)。

Tab 4 Effects of GBE on the level of AGEs of lens in diabetic rats(±s，n=6)

Tab 4 Effects of GBE on the level of AGEs of lens in diabetic rats(±s，n=6)

#P＜0.01 vs NS group;*P＜0.05 vs DC group

Group AGEs/ng·g-1Pro NS 8.77±1.02 DC 16.91±2.40# GL 15.07±2.77 GM 14.31±2.08 GH 13.70±2.33* BDL 15.01±3.06

Fig 2 Effect of GBE on the expression of AR of lens in diabetic rats(±s，n=6)

3 討論

白內(nèi)障(cataract)即晶狀體混濁，老化、遺傳、代謝異常等因素可引起晶狀體代謝紊亂，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性而出現(xiàn)混濁，發(fā)生白內(nèi)障，糖尿病是其重要的危險(xiǎn)因素之一［8］。大量研究表明，糖尿病患者白內(nèi)障的發(fā)生率明顯高于非糖尿病患者，且晶狀體混濁的發(fā)生速度更快，表明高糖在DC形成過(guò)程中是始動(dòng)因素，且是晶狀體混濁的主要誘發(fā)因素。長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)室研究和臨床觀察對(duì)DC的發(fā)病機(jī)制提出了多種不同的學(xué)說(shuō)，其中較為成熟的學(xué)說(shuō)主要有3種，即多元醇代謝異常學(xué)說(shuō)、非酶糖基化學(xué)說(shuō)和氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)［9］。近期研究更傾向認(rèn)為DC是多種機(jī)制綜合作用的結(jié)果，這幾種機(jī)制相互關(guān)聯(lián)，都參與了白內(nèi)障的形成。

氧化應(yīng)激在DC的病理進(jìn)程中扮演著非常重要的角色。大量證據(jù)表明，在高糖環(huán)境下，葡萄糖自身氧化作用、葡萄糖非酶糖基化形成晚期糖基化終末產(chǎn)物的過(guò)程中、高糖激活的多元醇途徑以及PKC的活化均產(chǎn)生大量ROS，從而消耗大量還原性谷胱甘肽，嚴(yán)重削弱機(jī)體的抗氧化防御系統(tǒng)，使其處于氧化應(yīng)激狀態(tài)［10-11］。超氧化物歧化酶、谷胱甘肽和過(guò)氧化氫酶均是晶狀體內(nèi)抗氧化的關(guān)鍵物質(zhì)，我們對(duì)晶狀體中這3種酶進(jìn)行測(cè)定后，發(fā)現(xiàn)在糖尿病大鼠晶狀體組織中它們的活性或含量均明顯下降。這樣的變化必然會(huì)導(dǎo)致晶狀體更易受到氧化劑的攻擊，致使晶狀體蛋白質(zhì)發(fā)生氧化損傷，最終發(fā)生晶狀體混濁。在本實(shí)驗(yàn)中，GBE能夠明顯提高DC大鼠晶狀體內(nèi)CAT、T-SOD的酶活性及GSH的含量，幫助維持晶狀體內(nèi)正常的氧化還原狀態(tài)，且與對(duì)照藥BDL相比，GBE的抗氧化作用更強(qiáng)也更廣泛。這可能是由于GBE能夠有效地阻止氧自由基進(jìn)入晶狀體組織，抵抗氧自由基對(duì)蛋白質(zhì)、膜磷脂和核酸造成的氧化損傷，同時(shí)消除氧自由基反應(yīng)生成的其他有害物質(zhì)。

AGEs是由蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及DNA等與還原糖之間形成的非酶促糖基化終末產(chǎn)物，其形成是一個(gè)不可逆的化學(xué)過(guò)程，一經(jīng)形成即不斷累積于組織中，影響組織的結(jié)構(gòu)和功能。AGEs的形成被認(rèn)為是糖基化過(guò)程中的中介體，存在于包括糖尿病性白內(nèi)障在內(nèi)的多種糖尿病并發(fā)癥中。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病患者白內(nèi)障的房水中AGEs產(chǎn)物大量堆積，證實(shí)了AGEs與糖尿病患者白內(nèi)障的發(fā)病密切相關(guān)［12］。此外，AGEs的產(chǎn)生與氧化應(yīng)激也有著密切的聯(lián)系。氧化應(yīng)激狀態(tài)的持續(xù)存在可促進(jìn)AGEs的不斷生成，同時(shí)AGEs與其受體的結(jié)合又可刺激ROS的產(chǎn)生，氧化應(yīng)激和AGEs相互作用、互相上調(diào)，共同加速DC的形成［13］。本實(shí)驗(yàn)中，DC組大鼠晶狀體中的AGEs相對(duì)含量與正常對(duì)照組相比明顯升高;高劑量的GBE能使AGEs水平下降，說(shuō)明GBE能夠有效降低DC大鼠晶狀體中AGEs的生成和積聚，這對(duì)DC的防治頗具意義。而B(niǎo)DL治療組大鼠的晶狀體AGEs含量未有明顯降低。

多元醇代謝通路是葡萄糖代謝通路之一，與DC的病理進(jìn)程有著極其密切的關(guān)系，AR是該通路的限速酶也是氧化還原通路的最后的共同步驟。已有研究發(fā)現(xiàn)，AR在晶狀體是高糖誘發(fā)氧化應(yīng)激的關(guān)鍵酶。在晶狀體過(guò)度表達(dá)AR的小鼠上，其DC的形成可大大提前［14］。多元醇通路的激活還會(huì)引起NADPH的大量消耗和NADH聚集，導(dǎo)致來(lái)源于二羥基丙酮磷酸鹽的二酰甘油明顯增加，激活蛋白激酶C，生成氧自由基，造成氧化應(yīng)激，加速糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展［15］。本實(shí)驗(yàn)中，DC大鼠的AR表達(dá)明顯增多，表明高糖能使AR表達(dá)上調(diào)。高劑量GBE即可明顯抑制其表達(dá)，因此GBE可以改善因AR表達(dá)增多所誘發(fā)的一系列與DC相關(guān)的癥狀; BDL由于是AR抑制劑，其抑制AR表達(dá)的效果更為明顯。

綜合以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，GBE可減輕大鼠糖尿病性白內(nèi)障引起的晶狀體混濁，這種作用可能與GBE抑制AGEs產(chǎn)生、AR表達(dá)以及蛋白質(zhì)氧化損傷有關(guān)，展現(xiàn)出GBE作為天然藥物多靶點(diǎn)治療的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)也為多元醇代謝異常學(xué)說(shuō)、非酶糖基化學(xué)說(shuō)和氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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