牛秀瓏，王 越，徐瑞成

(中國人民武裝警察部隊后勤學院1.天津市職業(yè)與環(huán)境危害生物標志物重點實驗室、2.免疫學教研室，天津 300162)

哇巴因是一種植物來源的強心苷類固醇(cardiotonic steroids，CSs)，是細胞膜鈉鉀ATP酶(Na+，K+-ATPase，NKA)的特異性配體和抑制劑。近年來有證據(jù)顯示，哇巴因尚有可能作用于雌激素受體(estrogen receptor，ER)發(fā)揮生物學活性。首先，哇巴因是一種類固醇衍生物，與幾種ER配體如17β-雌二醇(17β-estradiol，E2)、乙炔雌二醇(ethinyl estradiol，EE)結(jié)構(gòu)相似，即均具有一個共同的類固醇母核結(jié)構(gòu)。其次，在調(diào)節(jié)NKA方面哇巴因與E2、EE的某些功能相似，如哇巴因與EE均可抑制幾種組織的NKA活性［1－2］。以計算機為基礎(chǔ)的排列分析表明ERα的323-395氨基酸序列與NKA的α亞單位部分相似［3］，提示ERα的323-395序列是哇巴因潛在結(jié)合位點，類似序列也在ERβ上發(fā)現(xiàn)。同時，哇巴因［4］與E2［5］均可介導(dǎo)共同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如PI3K/Akt通路等。此外，近期一項篩選研究表明，哇巴因尚具有抗雌激素活性［6］。

乳腺癌為雌激素依賴性腫瘤，其ER亞型ERα和ERβ的表達狀態(tài)及比率是影響乳腺癌發(fā)生、發(fā)展及內(nèi)分泌療效的重要因素［7］。研究發(fā)現(xiàn)［8］，人乳腺癌細胞也可表達NKA，低濃度哇巴因可抑制人乳腺癌細胞增殖［9］。本文選擇兼有兩種ER亞型表達的人乳腺癌細胞株MCF-7為研究對象，首先確定低濃度哇巴因?qū)θ橄侔┘毎鲋车囊种谱饔檬欠褚蕾囉贓R，在此基礎(chǔ)上進一步探討ER亞型在哇巴因介導(dǎo)的增殖抑制中的作用。本文可為闡明哇巴因等CSs藥物抗乳腺癌治療的機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌細胞株 MCF-7(ERαhigh/ ERβhigh)為本室保存;哇巴因購自美國Sigma公司，無水乙醇溶解成濃度為0.001 mol·L－1的貯存液，－20℃避光保存，實驗時用無血清培養(yǎng)基稀釋(乙醇終濃度控制在＜0.1%);RPMI 1640培養(yǎng)基為美國Gibco公司產(chǎn)品;優(yōu)質(zhì)胎牛血清(FBS)購自中美合資蘭州民海生物工程有限公司;純ER阻斷劑ICI 182，780、MTT、DMSO為美國Sigma公司產(chǎn)品;小干擾 RNA(siRNA)pGenesil-ERα-siRNA、pGenesil-ERβ-siRNA、pGenesil-scramble-siRNA(陰性對照)均以質(zhì)粒pGenesil-1為載體，由武漢晶賽生物科技公司設(shè)計合成;脂質(zhì)體LipofectamineTM2 000、G418為美國Invitrogen公司產(chǎn)品;BCA蛋白定量試劑盒、化學發(fā)光底物檢測試劑盒購自美國 Pierce公司;抗ERα單克隆抗體、抗ERβ單克隆抗體(兔源性，1∶300稀釋)購自加拿大Millipore公司;抗β-actin多克隆抗體(小鼠源性，1∶1 000稀釋)購自美國Santa Cruz公司;HRP標記的羊抗兔二抗、羊抗小鼠二抗(1∶3 000稀釋)購自美國KPL公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測細胞增殖活性 取對數(shù)生長期MCF-7細胞接種96孔板，接種密度為4×103/孔，37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，更換含有1%FBS的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h使細胞同步化。加入不同終濃度的哇巴因(0.001、0.01、0.1、1、10、100、1 000、10 000 nmol·L－1)作用24 h，每個濃度設(shè)5個復(fù)孔，同時以藥物稀釋液為對照組。1 700 r ·min－1離心10 min，棄上清，加入MTT(0.5 g· L－1，PBS配制)100 μl/孔繼續(xù)孵育4 h，離心棄上清后加入DMSO 100 μl/孔，振蕩混勻，酶標儀測定波長為570 nm的吸光度值(A570)。計算細胞存活率/%=A實驗組/A對照組×100%。

1.2.2 ER阻斷劑處理細胞 細胞接種方法同上，取哇巴因作用明顯的劑量(1、10、100、1 000 nmol· L－1)，按上述方法行MTT檢測，在加入哇巴因之前先加入終濃度為100 μmol·L－1的ER阻斷劑ICI 182，780 37℃作用30 min，同時設(shè)立ICI 182，780藥物稀釋液為對照組。

1.2.3 RNA干擾技術(shù)沉默ERα或ERβ基因表達采用脂質(zhì)體法分別將干擾ERα或ERβ基因表達的質(zhì)粒，即 pGenesil-ERα-siRNA(簡稱 siERα)、pGenesil-ERβ-siRNA(簡稱siERβ)和無效干擾序列pGenesil-scramble-siRNA(簡稱HK，陰性對照)導(dǎo)入MCF-7細胞。3種質(zhì)粒的 RNA干擾序列如下: siERα sense 5'-CTCATCCTCTCCCACATCA-3'，antisense 5'-TGATGTGGGAGAGGGATGAG-3';siERβ sense 5'-TCCCTGCTGTGATGAATTA-3'，antisense 5'-TAATTCATCACAGCAGGGC-3';HK sense 5'-GACTTCATAAGGCGCATGC-3'，antisense 5'-GCATGCGCCTTATGAAGTC-3'。按照脂質(zhì)體 LipofectamineTM

2 000說明書進行細胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后48h更換選擇培養(yǎng)基(無抗生素、含20%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液，經(jīng)預(yù)實驗測定G418壓力篩選濃度為100 mg ·L－1)，連續(xù)培養(yǎng)15 d后，無限稀釋法挑選陽性克隆擴大培養(yǎng)，Western blot技術(shù)檢測干擾效果。建立的細胞穩(wěn)定表達株命名為:M/HK(ERαhigh/ERβhigh，陰性對照)、M/siα(ERα基因沉默細胞株，ER表達狀態(tài):ERαlow/ERβhigh)、M/siβ(ERβ基因沉默細胞株，ER表達狀態(tài):ERαhigh/ERβlow)。

1.2.4 蛋白印跡(Western blot)技術(shù)檢測ER蛋白表達 取對數(shù)生長期細胞1×106，接種于60 mm細胞培養(yǎng)皿，培養(yǎng)24 h后常規(guī)提取各組細胞的總蛋白。以BCA檢測定量。將40 μg蛋白經(jīng)10%SDSPAGE凝膠電泳分離后，電轉(zhuǎn)移至PVDF濾膜。濾膜經(jīng)5%脫脂奶室溫封閉1 h→一抗4℃溫和震蕩過夜→TBST洗滌3次→HRP標記二抗室溫溫育1 h→TBST洗滌3次后，經(jīng)化學發(fā)光底物檢測試劑盒檢測信號強度。結(jié)果應(yīng)用 Bio-Rad公司的 Quantity One軟件進行分析，以β-actin作為內(nèi)參照，以靶蛋白/β-actin灰度的比值作為蛋白的相對表達豐度，進行半定量檢測以確定干擾效果。對照細胞MCF-7、M/HK和ER基因沉默細胞M/siα、M/siβ分別按“1.2.1”所示方法進行MTT檢測。

1.3 統(tǒng)計學分析 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件包進行處理。計量資料以±s的形式表示，組間比較應(yīng)用單因素方差分析(One-way ANOVA)。

2 結(jié)果

2.1 哇巴因?qū)CF-7細胞增殖活性的影響 MTT檢測結(jié)果顯示(Fig 1)，哇巴因可明顯抑制MCF-7細胞的增殖活性。在0.1～1 000 nmol·L－1濃度范圍內(nèi)，該抑制作用具有劑量依賴性(P＜0.05)。與對照組相比，0.1、1、10、100、1 000 nmol·L－1濃度組的P值分別為0.008、0.008、0.006、0.000和0.000，因此在后續(xù)實驗中，以1、10、100、1 000 nmol·L－1作為哇巴因的有效劑量。

Fig 1 Effects of ouabain on the proliferation of MCF-7

2.2 ER阻斷劑部分阻斷哇巴因的增殖抑制作用

為了觀察哇巴因?qū)CF-7細胞的增殖抑制作用是否由ER途徑介導(dǎo)，我們在加入哇巴因(1、10、100、1000 nmol·L－1)前30 min先用ER阻斷劑ICI 182，780(100 μmol·L－1)處理細胞(ER阻斷劑預(yù)處理之細胞命名為M/ICI)，而后應(yīng)用MTT法檢測細胞存活率。結(jié)果如Fig 2所示，ICI 182，780作用后，哇巴因?qū)毎脑鲋骋种谱饔脺p弱，以1、10、100 nmol·L－1組最為明顯(與相應(yīng)濃度未經(jīng)ER阻斷劑預(yù)處理之MCF-7細胞相比，P值分別為0.007、 0.000和0.000)，提示哇巴因?qū)CF-7細胞的增殖抑制作用可經(jīng)由ER途徑介導(dǎo)。

Fig 2 Effects of ICI 182，780 on the inhibitory activity of ouabain

2.3 RNA干擾技術(shù)構(gòu)建ERα/ERβ不同表達狀態(tài)的乳腺癌細胞株 為進一步觀察哇巴因?qū)CF-7細胞的增殖抑制作用是經(jīng)由ERα或ERβ或二者共同介導(dǎo)，我們采用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建了ERα/ERβ不同表達狀態(tài)的MCF-7細胞穩(wěn)定表達株。應(yīng)用Western blot技術(shù)鑒定，結(jié)果如Fig 3A和3B所示，MCF-7細胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染siERα或siERβ后，所篩陽性克隆中ERα或ERβ蛋白表達水平的最高抑制率分別為(77.7±3.3)%和(68.3±2.1)%，而陰性對照質(zhì)粒(HK)轉(zhuǎn)染細胞株的ER表達水平?jīng)]有變化。說明經(jīng)RNA干擾后成功構(gòu)建ERα/ERβ不同表達狀態(tài)的乳腺癌細胞株，命名為:M/HK(ERαhigh/ ERβhigh，陰性對照)、M/siα(ERαlow/ERβhigh)、M/siβ (ERαhigh/ERβlow)。

Fig 3 Expressions of ER isoforms in MCF-7 after RNA interference

2.4 哇巴因?qū)CF-7細胞的增殖抑制作用主要由ERα介導(dǎo) 應(yīng)用哇巴因處理MCF-7及其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞克隆，并用MTT技術(shù)檢測細胞增殖活性。結(jié)果如Fig 4所示，MCF-7與M/HK的細胞存活率差異無顯著性(P＞0.05);與MCF-7相比，哇巴因?qū)/siα細胞的增殖抑制明顯減弱(1、10、100 nmol· L－1濃度組P＜0.001，1 000 nmol·L－1濃度組P= 0.008)，M/siβ細胞則在10 nmol·L－1(P=0.007)和1 000 nmol·L－1濃度組(P=0.000)表現(xiàn)出差異。提示，在低濃度時(1、10、100 nmol·L－1)，哇巴因主要經(jīng)由ERα途徑介導(dǎo)增殖抑制活性，干擾ERα表達可部分阻斷哇巴因的抑制活性(與ER阻斷劑的阻斷結(jié)果相似)。

Fig 4 Effects of ER isoforms on the inhibitory activity of ouabain

3 討論

強心苷類固醇藥物(也稱洋地黃類藥物)是從植物中提取的類固醇衍生物，是細胞膜NKA的天然抑制因子，包括地高辛、洋地黃毒苷和哇巴因等，自發(fā)現(xiàn)至今一直作為正性肌力藥物用于心衰及房顫的治療。流行病學調(diào)查表明［10］，長期服用CSs藥物的心臟病患者患白血病、淋巴瘤的幾率低于正常對照人群;因心臟原因接受CSs藥物治療的乳腺癌患者，其死亡率和復(fù)發(fā)率也遠低于不接受CSs藥物治療的患者;提示CSs藥物用于腫瘤治療的潛在價值。近10年來，大量體外實驗表明［9，11－14］CSs可抑制包括肺癌細胞株、乳腺癌細胞株、前列腺癌細胞株、肝癌細胞株等在內(nèi)的腫瘤細胞增殖，并誘導(dǎo)細胞凋亡;此外，CSs類藥物在自然界含量豐富，種類多樣，故成為抗腫瘤化合物研究的一個熱點［15］。

盡管CSs可介導(dǎo)抗腫瘤作用，但長期服用CSs可能對心臟產(chǎn)生的毒副作用仍舊限制了這類藥物在腫瘤治療領(lǐng)域的發(fā)展。相關(guān)研究表明［16］，哇巴因在低濃度范圍內(nèi)即可對腫瘤細胞發(fā)揮明顯的增殖抑制作用;本研究也證實，哇巴因在0.1～1 000 nmol· L－1濃度范圍內(nèi)可以劑量依賴性方式明顯抑制MCF-7細胞的增殖活性。這種抗腫瘤活性的有效濃度(納摩爾級)明顯低于同類藥物產(chǎn)生心臟毒性的作用濃度，可在不抑制NKA離子轉(zhuǎn)運功能的情況下引起胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，繼而調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡［16－17］，因此CSs類藥物可作為高效、安全的抗腫瘤藥物進行研究。

NKA，又稱鈉泵，是CSs在體內(nèi)的特異性受體，一定濃度的哇巴因與NKA亞單位的特異性結(jié)合可抑制NKA的離子轉(zhuǎn)運功能，導(dǎo)致細胞膜維持極化狀態(tài)的能力下降，引起胞膜去極化，胞外鈣內(nèi)流增加。但研究顯示［16－17］，介導(dǎo)抗腫瘤活性的低濃度哇巴因并不引起細胞膜的去極化變化，表明該濃度范圍的哇巴因并未抑制胞膜上NKA的活性，因此哇巴因可能通過NKA和(或)其他受體啟動胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，繼而影響細胞增殖及凋亡相關(guān)蛋白的表達，從而抑制腫瘤細胞增殖并誘導(dǎo)細胞凋亡。本研究結(jié)果證實，哇巴因?qū)θ巳橄侔㎝CF-7細胞的增殖抑制作用可被ER阻斷劑ICI 182，780部分阻斷，提示哇巴因可通過ER信號通路對MCF-7細胞發(fā)揮作用;應(yīng)用哇巴因作用于本室構(gòu)建的ER亞型不同表達狀態(tài)的乳腺癌細胞，進一步證明哇巴因經(jīng)ER對MCF-7細胞的增殖抑制作用主要由ERα介導(dǎo)。近年來研究認為，雌激素的作用分為兩種，一種是長期(long term)的“基因組(genomic)”作用，由經(jīng)典的細胞內(nèi)ER介導(dǎo)，通過與雌激素反應(yīng)元件結(jié)合，并與其它轉(zhuǎn)錄因子相互作用，從而調(diào)節(jié)敏感基因的表達;另一種是快速或短期(short term)的“非基因組(nongenomic)”作用，由膜相關(guān)ER通過激活多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路所介導(dǎo)，其中與 NKA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路共有的(crosstalk)可能有 NF-κB和 Ras/Raf/MEK/ERK等［18－19］。提示哇巴因等CSs可能部分通過膜ER途徑尤其是ERα抑制乳腺癌細胞增殖，這種增殖抑制作用可能通過它們共同的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來實現(xiàn)，NKA結(jié)合ER可能是未來開發(fā)抗乳癌藥物的潛在重要靶點。

CSs作為一種新型抗腫瘤藥物，目前已進入臨床實驗階段。來源于牛角瓜屬類植物的半合成CSs——UNBS1450可通過減少細胞內(nèi)ATP生成、破壞細胞骨架、促進自噬效應(yīng)等方式抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，在歐洲已進入臨床Ⅱ期試驗［20］。我們的前期工作證明，植物來源的哇巴因和動物來源的華蟾毒配基可作用于肝癌HepG2細胞，減少CyclinA1/CDK2/PCNA復(fù)合體的生成、上調(diào)細胞周期負調(diào)控因子p21CIP1的表達并引起細胞周期S期阻滯［13－14］。本研究證實，哇巴因主要通過ERα信號通路對雌激素依賴性腫瘤如乳腺癌發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，NKA結(jié)合ER可能是未來開發(fā)抗乳癌藥物的潛在重要靶點。

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