馬慧敏，胡立芬，葉 英，朱玉林，李家斌

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科，2.安徽省細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)中心，3.安徽醫(yī)科大學(xué)細(xì)菌耐藥研究所，4.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，5.國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥化學(xué)三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥 230022)

不動(dòng)桿菌(acinetobacter)是醫(yī)院感染最常見的條件致病菌之一，廣泛分布于自然界、人體表面及體內(nèi)。碳青霉烯類抗菌藥物是治療不動(dòng)桿菌的王牌藥物，但隨著碳青酶烯類抗菌藥物在臨床的廣泛使用，在抗生素的選擇壓力下，耐碳青酶烯類不動(dòng)桿菌日趨增多，如何防止耐藥的進(jìn)一步蔓延是臨床上治療不動(dòng)桿菌感染亟待解決的問題。近年耐藥突變選擇窗(mutant selection window，MSW)理論的提出［1］為抑制耐藥問題提供了新的思路和方法。防耐藥突變濃度(mutant prevention concentration，MPC)是指防止耐藥突變菌株被選擇性富集擴(kuò)增所需的最低抗菌藥物濃度。它代表一個(gè)嚴(yán)格限制耐藥突變株選擇的抗菌藥物濃度閾值，可用于評(píng)價(jià)藥物的抗菌活性，反映藥物抑制耐藥突變菌株的選擇能力。目前關(guān)于碳青酶烯類聯(lián)合利福平對(duì)不動(dòng)桿菌的MPC影響研究尚未見報(bào)道。為此本研究觀察亞胺培南西司他丁(imipenem and cilastatin，IMP)或美羅培南(meropenem，MER)單用及分別與利福平(rifampicin，RFP)聯(lián)合應(yīng)用對(duì)不動(dòng)桿菌的MPC影響，探討聯(lián)用抗菌藥物降低MPC、縮小MSW的規(guī)律，為臨床合理聯(lián)用現(xiàn)有抗菌藥物、防止耐藥菌的產(chǎn)生提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 安徽省細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)中心2010年收集的臨床分離標(biāo)本。選取其中16株對(duì)亞胺培南、美羅培南均敏感的不動(dòng)桿菌臨床分離株。

1.2 菌株鑒定 不動(dòng)桿菌的鑒定以16S rDNA序列進(jìn)行分類鑒定。正向引物27F:5'-AGAGTTTGATC (C/A)TGGCTCAG-3'(對(duì)應(yīng)于E.coil 16S rDNA序列的第8～27個(gè)堿基位置)，反向引物 1492R:5'-TACGG(C/T)TACCTTGTTACGAC-3'(對(duì)應(yīng)于E.coil 16S rDNA的第1 492～1 510個(gè)堿基位置)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后直接交由上海生工生物工程技術(shù)公司進(jìn)行純化和序列測(cè)定。運(yùn)用Blast程序與數(shù)據(jù)庫(kù)中已存在的不動(dòng)桿菌16SrDNA序列進(jìn)行相似性比較分析。

1.3 抗菌藥物與培養(yǎng)基 IMP為杭州默沙東制藥產(chǎn)品;MER為日本住友制藥產(chǎn)品;RFP為沈陽(yáng)雙鼎制藥產(chǎn)品。M-H培養(yǎng)基購(gòu)自英國(guó)Oxiod公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 恒溫振蕩培養(yǎng)箱(國(guó)勝儀器廠，江蘇);細(xì)菌比濁儀(Oxiod，英國(guó));32R低溫離心機(jī)(Hettich，德國(guó));多點(diǎn)接種儀(AQS Manufacturing公司，英國(guó))。

1.5 最低抑菌濃度測(cè)定

1.5.1 測(cè)定單獨(dú)應(yīng)用時(shí)的MIC 按美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)2010年標(biāo)準(zhǔn)［2］采用瓊脂二倍稀釋法測(cè)定IMP、MER與RFP 3種抗菌藥物單獨(dú)用藥時(shí)的MIC并判斷結(jié)果。

1.5.2 測(cè)定聯(lián)合應(yīng)用時(shí)的MIC 采用簡(jiǎn)化棋盤法測(cè)定IMP、MER分別與RFP聯(lián)用時(shí)的MIC。

1.5.3 計(jì)算部分抑菌濃度(fractional inhibitory concentration，F(xiàn)IC)指數(shù) FIC指數(shù) =A藥聯(lián)合時(shí)的MIC/A藥單用時(shí)的MIC+B藥聯(lián)合時(shí)的MIC/B藥單用時(shí)的MIC。

1.5.4 判定標(biāo)準(zhǔn) FIC指數(shù)≤0.5為協(xié)同作用;0.5＜FIC指數(shù)≤4為無(wú)關(guān)作用;FIC指數(shù)＞4為拮抗作用。判定標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)［3］。

1.6 防耐藥突變濃度(MPC)的測(cè)定［4-5］

1.6.1 含單藥瓊脂平板的配制 分別配制IMP、MER、RFP的MH瓊脂平板，以IMP、MER、RFP各自的MIC為最低濃度，通過(guò)二倍稀釋法配制1×MIC，2×MIC，4×MIC，8×MIC…，多個(gè)濃度系列的瓊脂平板，使藥物終濃度分別為IMP:0.125、0.25、0.5、1、2、…、128 mg·L-1，MER:0.125～128 mg·L-1，RFP:2～1 024 mg·L-1，每個(gè)濃度4個(gè)平板。

1.6.2 含兩藥瓊脂平板的配制 以IMP和MER的MIC、MPC為基準(zhǔn)，采用二倍稀釋法配制含IMP和MER與RFP混合的MH瓊脂平板。具體方法:分別精密量取1 ml不同稀釋倍數(shù)濃度的IMP或MER+1 ml 80.0 mg·L-1RFP(RFP推薦給藥劑量下人體平均血藥濃度為4.0 mg·L-1，見文獻(xiàn)［6］)+ 18 ml MH培養(yǎng)基，在90 mm平皿中混勻，配制成一系列不同濃度梯度的含兩藥平板，最低濃度為IMP和MER的MIC，最高濃度為IMP和MER的單藥MPC，每個(gè)濃度4個(gè)平板。冷卻后置37℃孵箱中以除去瓊脂表面水分。

1.6.3 菌懸液制備 從新鮮過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌平板上挑取單個(gè)菌落接種于20 ml MH肉湯中37℃120次/分震蕩過(guò)夜培養(yǎng)，3 000 r·min-1離心后棄上清，再懸浮在200 ml MH肉湯中，震蕩培養(yǎng)6 h，3 000 r ·min-1離心棄上清，調(diào)整菌液濃度為3×1010CFU ·ml-1。

1.6.4 MPC的測(cè)定 取100 μl 3×1010CFU·ml-1菌液均勻涂布于含不同濃度藥物的MH平板上，每個(gè)濃度4個(gè)平板，使每個(gè)藥物濃度的細(xì)菌接種量為1.2×1010CFU。37℃培養(yǎng)72 h，以4個(gè)平板均無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為MPC。對(duì)含單藥瓊脂平板的測(cè)定為單藥MPC，對(duì)含兩藥瓊脂平板的測(cè)定即為聯(lián)合用藥后的MPC。對(duì)接近MPC藥物濃度篩選出來(lái)的菌株接種于無(wú)藥物的MH平皿，傳代2次后再接種于原篩選藥物濃度的平板上，以確定其是耐藥突變株。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次，取其均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌鑒定結(jié)果 鮑曼不動(dòng)桿菌(acinetobacter baumanii)8株;瓊氏不動(dòng)桿菌(acinetobacter junii)5株;醋酸鈣不動(dòng)桿菌(acinetobacter calcoaceticus)3株。

2.2 抗菌藥物對(duì)16株不動(dòng)桿菌的MIC值 16株不動(dòng)桿菌對(duì)IMP、MER均敏感，MIC值范圍均為0.125～0.5，對(duì)RFP的MIC值范圍為2～4，見Tab 1。

Tab 1 MICs of 3 antimicrobial agents against 16 strains of Acinetobacter(mg·L-1)

2.3 聯(lián)合藥敏 IMP、MER分別與RFP聯(lián)用后以無(wú)關(guān)作用為主，未見拮抗作用，協(xié)同作用所占的比例分別為25%(4/16)和6%(1/16)。如Tab 2所示。

Tab 2 FICs of imipenem or meropenem combination with rifampicin against 16 strains of Acinetobacter

2.4 抗菌藥物單用及聯(lián)合使用對(duì)不動(dòng)桿菌的MPC和SI值 RFP單用對(duì)16株不動(dòng)桿菌的MPC均＞1 024 mg·L-1。IMP或MER單用對(duì)16株不動(dòng)桿菌的選擇指數(shù)(selectiveity index，SI=MPC/MIC)均為16～128;分別與RFP聯(lián)合使用SI均下降為1～32， IMP、MER單用對(duì)16株不動(dòng)桿菌的MPC均為8～32，與RFP聯(lián)合使用MPC分別下降為0.25～8和0.5～8。見Tab 3。

Tab 3 MPCs(mg·L－1)and SIs for imipenem and meropenem alone and in combination with rifampicin respectively against 16 strains of Acinetobacter

3 討論

不動(dòng)桿菌可以引起多種醫(yī)院感染，具有多重耐藥性，全世界范圍內(nèi)包括中國(guó)在內(nèi)的多個(gè)國(guó)家的醫(yī)院已經(jīng)出現(xiàn)多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌(multidrug-resistant acinetobacter baumanni，MDR-Ab)的暴發(fā)和流行。MDR-Ab治療困難，病死率高，是目前臨床治療的難題。不動(dòng)桿菌對(duì)一線藥物碳青霉烯類的耐藥率已從2003年的4.5%上升至2008年的48.1%～49.3%［7-8］。從MSW理論［1］來(lái)看:不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類藥物的耐藥率之所以在短時(shí)間內(nèi)迅速上升，可能是由于體內(nèi)碳青霉烯類藥物濃度處于不動(dòng)桿菌的MIC和MPC之間，導(dǎo)致耐藥突變株被選擇性富集擴(kuò)增，從而產(chǎn)生耐藥。MPC是MSW的上限，當(dāng)藥物濃度高于MPC時(shí)，病原菌必須同時(shí)發(fā)生兩次或更多次耐藥突變才能生長(zhǎng)，這樣出現(xiàn)耐藥突變體的概率將很低。Credito等［9］也提出當(dāng)碳青霉烯類藥物濃度達(dá)到MPC以上時(shí)，才可能有效防止耐碳青酶烯類藥物突變體的產(chǎn)生，并測(cè)定了25株鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離株對(duì)IMP的MPC50和MPC90值分別為4 mg·L-1和 64 mg·L-1，對(duì) MER的 MPC50和MPC90值分別為8 mg·L-1和128 mg·L-1。這與本研究顯示的16株敏感不動(dòng)桿菌對(duì)IMP和MER的MPC均為8～32 mg·L-1的結(jié)果稍有不同。這可能與上述25株鮑曼不動(dòng)桿菌中包括部分碳青霉烯中介菌株有關(guān)。結(jié)合藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析，按臨床推薦藥物劑量0.5 g單次靜脈輸注后，IMP和MER血漿峰濃度Cmax分別為35 mg·L-1和26 mg·L-1，本研究中有10株不動(dòng)桿菌IMP的MPC值是8和16 mg·L-1，11株菌MER的MPC值也是8和16 mg· L-1，都低于血漿峰濃度Cmax，因此對(duì)于這些菌單獨(dú)應(yīng)用碳青酶烯類藥物可能會(huì)限制耐藥突變體的產(chǎn)生。然而還有6株菌IMP的MPC值是32 mg· L-1，5株菌MER的MPC值是32 mg·L-1，都接近血漿峰濃度，而且IMP和MER在腦脊液等組織中的濃度低于血藥濃度［10］，因此感染部位的藥物濃度往往落在MSW之內(nèi)，若要增大給藥劑量，可能產(chǎn)生較嚴(yán)重的副作用，所以此類藥物單獨(dú)使用不能完全限制耐藥突變體富集。

MSW理論提出了一種限制耐藥突變體產(chǎn)生的方法:當(dāng)2種不同作用機(jī)制的抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用，并同時(shí)處于各自的MIC以上時(shí)，細(xì)菌需要同時(shí)發(fā)生2種耐藥突變才能生長(zhǎng)［11］，從而關(guān)閉或縮小MSW，防止耐藥菌產(chǎn)生。孫恩華等［12］報(bào)道美羅培南、頭孢他啶分別與環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、阿米卡星、阿奇霉素聯(lián)合可以降低對(duì)銅綠假單胞菌的SI。梅清等［5］應(yīng)用萬(wàn)古霉素聯(lián)合利福平或磷霉素可以縮小耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥突變選擇窗。近年來(lái)利福平治療多重耐藥不動(dòng)桿菌(MDR-Ab)的研究多有報(bào)道，體外和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均證實(shí)利福平治療MDR-Ab有效［13］，Pachón-Ibá?ez等［14-15］的研究證明RFP聯(lián)用亞胺培南對(duì)多重耐藥及泛耐藥不動(dòng)桿菌引起的動(dòng)物肺炎及腦膜炎模型療效較好。且體外聯(lián)合藥敏結(jié)果顯示，IMP或MER聯(lián)合RFP協(xié)同作用分別為25%和6%，以無(wú)關(guān)作用為主，無(wú)拮抗作用。這與Kiratisin等［16］報(bào)道IMP和MER分別與RFP對(duì)15株非多重耐藥不動(dòng)桿菌聯(lián)合用藥，協(xié)同作用所占比例均為6.7%，均無(wú)拮抗作用的結(jié)果接近，因此碳青霉烯類抗菌藥物與RFP聯(lián)合用藥具有可行性。本研究中IMP或MER與RFP聯(lián)合使用后，MPC由單用時(shí)的8～32，分別下降為0.25～8和0.5～8，SI均由單用時(shí)的16～128下降為1～32，均下降了2～32倍，甚至出現(xiàn)了關(guān)閉MSW的情況，2號(hào)菌株關(guān)閉了IMP的MSW。4號(hào)菌株關(guān)閉了MER的MSW。本研究結(jié)果證實(shí)了IMP或MER與RFP聯(lián)合使用能縮小甚至關(guān)閉MSW，減少耐碳青霉烯不動(dòng)桿菌的出現(xiàn)。

本研究初步探討了碳青霉烯類抗菌藥物與RFP聯(lián)合對(duì)不動(dòng)桿菌MPC的影響，證實(shí)此種聯(lián)合方案能降低IMP和MER的MPC，縮小甚至關(guān)閉MSW，能有效防止耐藥突變體的富集。這為臨床合理應(yīng)用碳青酶烯類抗菌藥物治療不動(dòng)桿菌感染，減少耐碳青酶烯類不動(dòng)桿菌突變體的出現(xiàn)提供了理論依據(jù)。由于體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜、影響因素多，體內(nèi)藥物濃度不恒定，與體外研究存在一定的差異，因此尚需進(jìn)行動(dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證聯(lián)合用藥時(shí)藥物代謝動(dòng)力學(xué)與耐藥突變體選擇的關(guān)系。

［1］ Zhao X，Drlica K.Restricting the selection of antibiotic-resistant mutants:A general strategy derived from fluoroquinolone studies［J］.Clin Infect Dis，2001，33(Suppl 3):147-56.

［2］ Clinical and Laboratory Standards Institute/NCCLS.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing;twentieth informational supplement［S］.CLSI Document，2010，30(1):1-153.

［3］ Odds F C.Synergy，antagonism，and what the chequerboard puts between them［J］.J Antimicrob Chemother，2003，52:16.

［4］ 李朝霞，劉又寧，王 睿，等.左氧氟沙星聯(lián)合萬(wàn)古霉素縮小金黃色葡萄球菌耐藥突變選擇窗的初步研究［J］.中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2007，12(8):911-4.

［4］ Li Z X，Liu Y N，Wang R，et al.Preliminary study for narrowing mutant selection window of Staphylococcus aureus by combination of levofloxacin and Vancomycin in vitro［J］.Chin J Clin Pharmacol Ther，2007，12(8):911-4.

［5］ 梅 清，喻 婷，朱玉林，等.萬(wàn)古霉素單用及聯(lián)合利福平或磷霉素對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌防耐藥突變濃度的研究［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2011，27(7):944-7.

［5］ Mei Q，Yu T，Zhu Y L，et al.Study on mutant prevention concentrations of vancomycin alone and in combination with rifampicin or fosfomycin against MRSA［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27 (7):944-7.

［6］ Kucers A，Scrowe S，Grayson M L，et al.The use of antibiotics: a clinical review of antibacterial，antifungal，and antiviral drugs［M］，5th ed.Boston，Mass:Butterworth-Heinemann，1997:676 -700.

［7］ 汪 復(fù)，朱德妹，胡付品，等.2008年中國(guó)CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)［J］.中國(guó)感染與化療雜志，2009，9(5):321-9.

［7］ Wang F，Zhu D M，Hu F P，et al.CHINET 2008 surveillance of bacterial resistance in China［J］.Chin J Infect Chemother，2009，9(5):321-9.

［8］ 王 輝，郭 萍，孫宏莉，等.碳青霉烯類耐藥的不動(dòng)桿菌分子流行病學(xué)及其泛耐藥的分子機(jī)制［J］.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2006，9(12):1066-73.

［8］ Wang H，Guo P，Sun H L，et al.Molecular epidemiology and resistant mechanisms of carbapenem-resistant Acinetobacter species［J］.Chin J Lab Med，2006，9(12):1066-73.

［9］ Credito K，Kosowska-Shick K，Appelbaum P C.Mutant prevention concentrations of four carbapenems against gram-negative rods［J］.Antimicrob Agents Chemother，2010，54(6):2692-5.

［10］張 維，張 杰.碳青霉烯類抗生素的藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)研究進(jìn)展［J］.中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志，2007，27(5):386-9.

［10］ Zhang W，Zhang J.Pharmacokinetics and pharmacodynamics study progress of carbapenems［J］.Chin J Pract Inter Med，2007，27(5):386-9.

［11］ Drlica K.The mutant selection window and antimicrobial resistance［J］.J Antimicrob Chemother，2003，52(1):7-11.

［12］孫恩華，劉明濤，畢少杰，等.美羅培南及頭孢他啶與其他抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用對(duì)銅綠假單胞菌耐藥突變選擇窗的研究［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2011，21(4):631-3.

［12］Sun E H，Liu M T，Bi S J，et al.Impact of meropenem and ceftazidime combined with other antibiotics on mutant selection window to pseudomonas aeruginosa in vitro［J］.Chin J Nosocomiol，2011，21(4):631-3.

［13］Pachón J，Vila J.Treatment of multiresistant Acinetobacter baumannii infections［J］.Curr Opin Investig Drugs，2009，10(2): 150-6.

［14］Pachón-Ibá?ez M E，Docobo-Pérez F，López-Rojas R，et al.Efficacy of rifampin and its combinations with imipenem，sulbactam and colistin in experimental models of infection caused by imipenem-resistant acinetobacter baumannii［J］.Antimicrob Agents Chemother，2010，54(3):1165-72.

［15］Pachón-Ibá?ez M E，Docobo-Pérez F，Jiménez-Mejias M E，et al.Efficacy of rifampin，in monotherapy and in combinations，in an experimental murine pneumonia model caused by panresistant Acinetobacter baumannii strains［J］.Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2011，30(7):895-901.

［16］Kiratisin P，Apisarnthanarak A，Kaewdaeng S.Synergistic activities between carbapenems and other antimicrobial agents against Acinetobacter baumannii including multidrug-resistant and extensively drug-resistant isolates［J］.Int J Antimicrobial Agents，2010，36(3):243-6.