吳正升，吳 強(qiáng)

(安徽醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，安徽合肥 230032)

近年來，雖然乳腺癌的診療技術(shù)和手段有了一定的發(fā)展，但是乳腺癌的侵襲性生長和轉(zhuǎn)移仍是導(dǎo)致患者死亡的重要原因之一。研究發(fā)現(xiàn)微小RNA (miRNA)可通過調(diào)控靶基因的表達(dá)，在乳腺上皮細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮重要作用［1－3］。本課題組前期通過miRNA芯片篩查了不同侵襲活性的人乳腺上皮細(xì)胞;通過比較其miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)多種差異性表達(dá)的miRNA，提示這些miRNA可能參與了細(xì)胞侵襲活性的調(diào)控［4－5］。miR-96是其中具有顯著差異性表達(dá)的miRNA之一。為此，本研究通過實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證miRNA芯片中miR-96的表達(dá)結(jié)果;并以乳腺癌細(xì)胞株MCF-7為模型，通過miRNA抑制物轉(zhuǎn)染技術(shù)，分析下調(diào)miR-96表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺上皮細(xì)胞系HBL-100、人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231和MDA-MB-468均購自美國典藏細(xì)胞庫(ATCC);收集安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2009年7月至2010年6月間乳腺病例28例，其中乳腺癌17例，乳腺良性病變［纖維腺瘤和(或)腺?。?1例，患者均為女性，所有患者術(shù)前未做化療、免疫或放射等抗腫瘤治療。所有新鮮組織切除后快速置于液氮速凍后儲存于－70℃。

1.2 試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基、L15培養(yǎng)基和DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Corning公司;胎牛血清購自美國Hyclone公司;脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司;miRNA提取試劑盒和miR-96熒光定量PCR檢測試劑盒均購自美國Ambion公司; miR-96抑制物和陰性對照購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司;MTS細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自美國Promega;侵襲小室購自美國Corning公司;基質(zhì)膠購自美國BD公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞株和新鮮組織中miR-96表達(dá)的檢測 HBL-100細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基中、MDA-MB-231和MDA-MB-468培養(yǎng)于L15培養(yǎng)基中，均添加體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清。10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿隔日傳代擴(kuò)增HBL-100、MCF-7、MDA-MB-231和MDAMB-468細(xì)胞，待細(xì)胞狀態(tài)良好，近90%融合時(shí)，以預(yù)冷PBS沖洗3次終止培養(yǎng)，冰上用刮棒刮取細(xì)胞、移入離心管，4℃、8 000 r·min－1離心10 min，去上清，收集細(xì)胞，備用;取乳腺新鮮組織100 mg，置于液氮預(yù)冷處理的研缽中，固化、研碎，備用。按照miRNA提取試劑盒說明，分別抽提4株細(xì)胞系和乳腺新鮮組織中總miRNA。按照Ambion公司的mir-VanaTMqRT-PCR miRNA檢測試劑盒說明，首先對各個(gè)細(xì)胞系和新鮮組織總miRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后在實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用U6作為內(nèi)參。

1.3.2 miR-96抑制物(ASO)的轉(zhuǎn)染 將乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞接種后24 h，待貼壁細(xì)胞達(dá)到30%～50%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，參照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書分別轉(zhuǎn)染miR-96 ASO和陰性對照(NC)。

1.3.3 細(xì)胞增殖活性的檢測 取轉(zhuǎn)染36 h后分別miR-96 ASO組和NC組MCF-7細(xì)胞，按照MTS細(xì)胞增殖檢測試劑盒說明，分別于接種96孔板后24、48、72和96 h各檢測1次。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 細(xì)胞侵襲和遷移活性的檢測 取轉(zhuǎn)染48 h后miR-96 ASO組和NC組MCF-7細(xì)胞，在Transwell小室接種細(xì)胞前1 d，在小室底部膜的上室面鋪基質(zhì)膠(遷移實(shí)驗(yàn)不加基質(zhì)膠)，按照Transwell小室說明，將侵襲小室下室加入含10%FBS RPMI 1640培養(yǎng)基，將侵襲小室上室加入各組細(xì)胞懸液。將侵襲小室置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h，倒置顯微鏡下觀察侵襲小室下室，待少量細(xì)胞穿出后中止實(shí)驗(yàn)。用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)細(xì)胞，4%多聚甲醛固定，0.25%考馬斯亮藍(lán)染色。正置顯微鏡下進(jìn)行觀察拍照，采用5個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 乳腺上皮細(xì)胞系和臨床乳腺病變組織中miR-96表達(dá) 本課題組前期使用miRNA芯片檢測了4種人乳腺細(xì)胞系HBL-100、MCF-7、MDA-MB-231和MDA-MB-468的miRNA表達(dá)譜，結(jié)果顯示高侵襲細(xì)胞系MDA-MB-231和MDA-MB-468中miR-96表達(dá)較低侵襲HBL-100和MCF-7細(xì)胞明顯下調(diào)(Fig 1)。為了驗(yàn)證芯片的結(jié)果，本研究中首先使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測了這4株細(xì)胞miR-96表達(dá)。如Fig 1所示，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果與芯片結(jié)果一致，即MDA-MB-231和MDA-MB-468中miR-96表達(dá)均較HBL-100和MCF-7細(xì)胞明顯下調(diào)(P＜0.01)。進(jìn)一步，如Fig 2所示:在臨床乳腺病變樣本中，17例新鮮乳腺癌組織miR-96表達(dá)也較11例乳腺良性病變組織明顯下調(diào)(P＜0.01)。

Fig 1 Relative expression of miR-96 in breast cell lines

2.2 miR-96對乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖活性的影響 將MCF-7細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-96 ASO和NC，使用MTS法檢測這兩組細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的增殖活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-96 ASO組與NC組相比，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的增殖活性差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。

Fig 2 Relative expression of miR-96 in breast tissue specimens of breast benign disease and breast cancer

2.3 miR-96對乳腺癌細(xì)胞MCF-7侵襲和遷移活性的影響 使用 Transwell小室檢測分別轉(zhuǎn)染了miR-96 ASO和NC的MCF-7細(xì)胞的侵襲和遷移活性。如Fig 3所示，通過轉(zhuǎn)染miR-96ASO下調(diào)MCF-7細(xì)胞內(nèi)源性miR-96表達(dá)后，乳腺癌MCF-7細(xì)胞穿過基質(zhì)膠的侵襲能力，以及遷移至小室膜的能力(未加入基質(zhì)膠的遷移實(shí)驗(yàn))均較對照組明顯提高(P＜0.01)。

3 討論

miRNA一類長約18～22 nt的單鏈非編碼RNA，它具有多種調(diào)控基因表達(dá)的功能。研究表明，miRNA廣泛存在于真核生物中，在細(xì)胞發(fā)育、分化、增殖、凋亡、代謝以及腫瘤發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移等過程中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)［2－3，6］，miRNA在多種常見惡性腫瘤中呈異常表達(dá)，并且其表達(dá)與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等特性相關(guān)［7－9］。乳腺癌miR-335表達(dá)與患者無轉(zhuǎn)移生存期呈正相關(guān)，提示其在乳腺癌中可能起到抑癌基因的作用［10］;而miR-10b在轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，并且與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，提示其可能起到癌基因的作用［11］。

為了探討miRNA參與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，本研究前期通過miRNA芯片技術(shù)檢測不同侵襲特性的人乳腺細(xì)胞株，篩選出大量差異性表達(dá)的miRNA，提示這些miRNA可能參與了乳腺癌侵襲過程［4－5］。前期miRNA芯片的研究結(jié)果表明，高侵襲性MDA-MB-231和MDA-MB-468細(xì)胞的miR-96表達(dá)量較低侵襲HBL-100和MCF-7細(xì)胞明顯下調(diào)。為了驗(yàn)證芯片中miR-96表達(dá)的結(jié)果，本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)再次檢測了這4種乳腺細(xì)胞株的miR-96表達(dá)狀況，結(jié)果與miRNA芯片一致。進(jìn)一步，本研究在臨床乳腺新鮮病變組織中檢測了miR-96的表達(dá)水平，結(jié)果顯示乳腺癌組織中miR-96也明顯下調(diào)，表明miR-96的表達(dá)下調(diào)可能與乳腺癌有關(guān)。但miR-96在乳腺癌發(fā)病過程中的具體作用及其對乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，目前尚未清楚。為此，本研究使用化學(xué)合成的miR-96抑制物轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞，下調(diào)細(xì)胞的 miR-196表達(dá)，觀察miR-96抑制物對細(xì)胞增殖、侵襲和遷移活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-96的下調(diào)對細(xì)胞增殖無明顯影響，卻可顯著提高乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移活性。

Fig 3 Effect of miR-96 on MCF-7 cell behaviors of migration and invasion

目前關(guān)于miR-96在腫瘤中的作用尚存在一定的爭議。Yu等［12］發(fā)現(xiàn)miR-96能夠明顯抑制胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，并且miR-96通過調(diào)控其靶基因KRAS表達(dá)可能發(fā)揮抑癌基因的作用，本研究結(jié)果也與其大致相符。Chen等［13］的研究結(jié)果表明，miR-96在高轉(zhuǎn)移性肝癌HCCLM6中呈高表達(dá)，而下調(diào)miR-96的表達(dá)能夠明顯抑制HCCLM6細(xì)胞的侵襲和遷移;Lin等［14］研究發(fā)現(xiàn)MCF-7等9株乳腺癌細(xì)胞miR-96表達(dá)較1株乳腺正常上皮細(xì)胞NBEC明顯增高，同時(shí)15例臨床乳腺癌腫瘤組織miR-96較對應(yīng)癌旁組織增高，并且miR-96具有促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖的作用，提示miR-96可能具有癌基因的作用。因此，miR-96的作用比較復(fù)雜，可能通過多種的靶基因在不同腫瘤、不同病變階段中發(fā)揮不同的功能。

綜上所述，miR-96在人乳腺癌細(xì)胞株和乳腺病變組織中存在表達(dá)失調(diào)，并對人乳腺癌細(xì)胞的侵襲及遷移能力可能存在一定負(fù)性調(diào)控作用。

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