康彥紅，勞海燕，陳秀云，麥麗萍，余細勇，，陳紀言，鐘詩龍，

(1.南方醫(yī)科大學藥學院，廣東廣州 510515;2.廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學研究中心，3.廣東省心血管病研究所，廣東廣州 510080)

經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)是近年來治療冠心病的重要措施之一。PCI術(shù)中對病變斑塊的擠壓、促凝組織的暴露以及支架等器械置入等可促進血小板激活、血栓形成，引發(fā)支架內(nèi)血栓、心肌梗死和死亡等臨床終點事件。因此，患者在PCI術(shù)后進行抗血小板治療是冠心病介入治療的基石。聯(lián)合使用阿司匹林和氯吡格雷雙重抗血小板(簡稱雙抗)治療可明顯改善PCI術(shù)后患者的主要心血管預(yù)后，是目前最重要的治療措施之一。雙抗治療效果明顯，但仍有10%～15%的患者在1年內(nèi)會出現(xiàn)包括死亡、心肌梗死和腦卒中等臨床終點事件［1－2］?？寡“逯委熜Ч牟町愔苯雨P(guān)系到PCI術(shù)后患者是否出現(xiàn)重大臨床不良事件，所以發(fā)現(xiàn)雙抗治療后終點事件的重要影響因素，并對其進行有效控制，對行PCI術(shù)的冠心病患者預(yù)后具有重要意義和臨床應(yīng)用價值。

Fig 1 CpGi of PON1 gene

產(chǎn)生氯吡格雷抵抗是由多種原因造成的，既與冠心病危險因素如肥胖、糖尿病、吸煙，藥物之間的相互作用等非遺傳因素相關(guān)，又與氯吡格雷體內(nèi)代謝通路的基因變異有著密切的關(guān)系。PON1是一種主要在肝臟合成的酶，參與了肝內(nèi)多種物質(zhì)的水解反應(yīng)。最近Bouman等在研究中指出，PON1是氯吡格雷體內(nèi)活化過程的關(guān)鍵酶之一，且外顯子區(qū)Gln192Arg突變能夠明顯影響行PCI術(shù)患者使用氯吡格雷后血小板的活化，能夠增加這類患者發(fā)生支架內(nèi)血栓的風險，但PON1 Gln192Arg對PCI術(shù)后終點事件的影響，沒有得到證實［3］。表觀遺傳學的研究提示PON1啟動子(－108位點)多態(tài)性對PON1基因的表達水平也有明顯影響。我們推測PON1啟動子CpG島區(qū)(Fig 1)基因多態(tài)性可能會影響氯吡格雷的抗血小板療效。因此本研究旨在探究氯吡格雷活化通路基因PON1啟動子基因多態(tài)性(－108C/ T，－126G/C和－162G/A)對接受氯吡格雷抗血小板治療的冠心病患者在PCI術(shù)后出現(xiàn)主要不良心臟事件(MACE)的影響。

1 材料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 樣本來源 經(jīng)廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的批準，根據(jù)本研究的納入和排除標準，于2010年1月～10月間從廣東省人民醫(yī)院入選538名PCI術(shù)后接受阿司匹林和氯吡格雷聯(lián)合抗血小板治療的中國漢族病人，男性449人，女性89人，年齡18～80歲。PCI術(shù)后接受阿司匹林與氯吡格雷聯(lián)合抗血小板治療的冠心病患者簽署知情同意書。

1.1.3 排除標準 年齡小于18周歲;在初次PCI術(shù)前10日內(nèi)曾口服抗凝藥物，且INR大于1.5，或者在住院期間使用抗凝藥物者;使用氯吡格雷和(或)阿司匹林的禁忌癥:活動性出血或有高度出血危險;嚴重的系統(tǒng)性出血病史，或出血體質(zhì)及凝血障礙等其他病史;未控制的高血壓;由于醫(yī)療、地理或其他社會因素使得患者不能入選本研究。

1.1.4 研究終點及一般資料 研究終點:MACE，定義為:一年內(nèi)發(fā)生以下聯(lián)合終點的任意1個:心源性死亡、心肌梗死、再次血運重建。

一般資料:與患者簽署知情同意書后，收集其基礎(chǔ)資料(包括年齡、性別、吸煙、高血壓史、糖尿病史、合并用藥及實驗室檢查資料等)，并進行術(shù)后1、3、6月和1年4個時間點的隨訪。

1.2 基因分型 PCI手術(shù)后d 2早上采集4 ml空腹靜脈血于硅烷化的 K2 EDTA抗凝管中并于－70℃凍存。使用Gentra Puregene Blood Kit(QIAGEN，上海，中國)并根據(jù)說明書提取血液基因組DNA。采用PCR直接測序的方法對PON1啟動子區(qū)3個基因多態(tài)性位點(－108C/T，－126 G/C和－162G/A)進行檢測。PCR擴增在普通 PCR儀(Eppendorf，美國)上使用 Go Taq?Green Master (Promega公司，美國)進行。PCR反應(yīng)體系為20 μl，包括10 μl GoTaq Green Master Mix，上下游引物各2 μl(10 μmol·L－1)，200 ng基因組DNA和 x μl無核酶水。其中，上游引物序列為5'-AGTGAGGAGGACGAAGG-3'，下游引物序列為5'-TTACAGTTGGAAGGAGCA-3'。反應(yīng)條件為95℃5 min，95℃35 s，56℃30 s，72℃1 min，38個循環(huán)，72℃5 min。PCR產(chǎn)物在英濰捷基(廣州，中國)進行測序并使用軟件Chromas.exe對測序結(jié)果進行比對。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 運用基因計數(shù)法計算各組基因型頻率及等位基因頻率，應(yīng)用擬合優(yōu)度卡方檢驗確定兩組基因型頻率分布是否符合Hardy-Weinberg (H-W)遺傳平衡。臨床資料中，分類變量用計數(shù)(%)表示，連續(xù)變量用中位數(shù)(media，Q1-Q3)表示。數(shù)據(jù)正態(tài)分布使用Shapiro-Wilk檢驗。單因素及多因素回歸分析法確定基因型及非遺傳因素導致MACE發(fā)生的危險比及校正危險比，數(shù)據(jù)處理使用SAS9.1(SAS Inst，Cary，NC)軟件進行統(tǒng)計分析。單倍體分析使用HPlus軟件進行［4－5］。

SNPs基因分型時，若某基因型頻率小于5%，則視為少見基因型，并將少見基因型合并入中間型。如，－126 G/C位點分型時分為CC+CG以及GG兩組。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 入選的所有患者在PCI術(shù)前均預(yù)先給予氯吡格雷300 mg或600 mg，術(shù)后使用雙抗(氯吡格雷75 mg·d－1和阿司匹林80～100 mg· d－1)治療。在隨訪期間，除發(fā)生終點事件外，入選患者均遵醫(yī)囑持續(xù)應(yīng)用氯吡格雷。入選的538名患者中，年齡中位數(shù)為64(Q1-Q3:56－72)，其中213名患者(39.59%)有長期吸煙經(jīng)歷。單因素回歸分析表明，患者合并高血壓(311名，57.81%)或合并糖尿病(123名，22.86%)時，MACE發(fā)生風險相對較高，HR(95%CI)分別為3.84(1.71－8.62)和2.72(1.49－4.97);患者同時應(yīng)用鈣離子拮抗劑時，MACE發(fā)生風險也較高，HR(95%CI)為2.69 (1.45－4.99)。詳見Tab 1。

Tab 1 Baseline characteristics and their effect on MACE

Tab 2 Genotype on MACE

2.2 不同基因型對MACE的發(fā)生風險影響不顯著所研究的3個多態(tài)性位點(－108C/T，－126G/C和－162G/A)中，突變基因攜帶對MACE的發(fā)生風險影響不明顯(校正P＞0.05)。－108C/T位點，突變等位基因T攜帶者與不攜帶突變等位基因者人數(shù)相當(T，47.86%);而－126G/C位點，突變等位基因C攜帶者僅占全部患者的18.22%，－162G/A位點，突變等位基因A攜帶者占24.91%。詳見Tab 2。

2.3 單倍型分析 對基因型使用HPlus軟件進行單倍型分析，結(jié)果表明，所研究PON1基因啟動子的3個多態(tài)性位點單倍型分布對MACE發(fā)生風險無影響(P＞0.05)。結(jié)果與單因素分析結(jié)果相似。詳見Tab 3。

Tab 3 Haplotype association of PON1 with MACE by cox regression

2.4 遺傳及非遺傳因素與MACE發(fā)生風險相關(guān)性

本研究采用多因素回歸分析(逐步回歸法，P＜0.10納入回歸模型)對遺傳及非遺傳因素進行回歸分析。結(jié)果表明，遺傳因素(－108C/T，－126G/C和－162G/A)對MACE發(fā)生風險無明顯影響;而非遺傳因素，如合并糖尿病(HR=2.279)、高血壓(HR =3.745)時，患者發(fā)生MACE的風險相對較高(P＜0.05)，與單因素分析結(jié)果相似。詳見Tab 4。

Tab 4 Results of a multivariable cox regression model on predictors of MACE

3 討論

氯吡格雷是一種前體藥物，進入體內(nèi)后須經(jīng)肝藥酶代謝才能產(chǎn)生活性物質(zhì)。其活性代謝產(chǎn)物通過抑制ADP與膜受體結(jié)合抑制了GPⅡ/Ⅲa受體的激活，進而抑制血小板聚集。氯吡格雷體內(nèi)活化過程分為兩個階段:第一階段為氧化反應(yīng)，即將氯吡格雷氧化為2-氧基-氯吡格雷，參與此氧化反應(yīng)的多種肝藥酶基因中以CYP2C19為主［6－8］;第二階段為水解反應(yīng)，即將2-氧基-氯吡格雷水解為硫醇類活性產(chǎn)物，參與此階段的肝藥酶主要為PON1［3］。目前已有大量的研究及Meta-分析表明CYP2C19可能是影響氯吡格雷療效的最主要的肝藥酶之一［9］，但PON1基因與氯吡格雷抗血小板聚集效應(yīng)的關(guān)系研究結(jié)果尚未一致［3，9－13］。PON1基因轉(zhuǎn)錄激活區(qū)富含“GGCGGG”，轉(zhuǎn)錄因子Sp1與其結(jié)合有激活基因轉(zhuǎn)錄的作用，對基因的表達有重要影響。近年來，有學者稱位于此轉(zhuǎn)錄激活區(qū)的－108C/T會通過影響其與Sp1結(jié)合進而影響基因的表達［14－15］。因此，此突變及其鄰近位點突變可能通過影響PON1基因的表達影響氯吡格雷活化過程，進而影響氯吡格雷抗血小板效應(yīng)。但在本研究中未能找到相同的結(jié)果，在中國漢族行PCI術(shù)的冠心病患者中，PON1基因啟動子區(qū)－108C/T，－126G/C和－162G/A均未對氯吡格雷抗血小板效應(yīng)產(chǎn)生明顯影響(P＞0.05)。氯吡格雷在體內(nèi)代謝過程復雜，通常只有15%的原型藥物可代謝為活性產(chǎn)物，而體內(nèi)85%的原藥都將成為非活性狀態(tài)。因此我們認為，在眾多參與氯吡格雷活化過程的基因中，PON1在整體上對氯吡格雷活化的影響可能不大［12］，在實驗中也未能觀察到其啟動子區(qū)多態(tài)性位點對氯吡格雷活化有明顯影響。

本研究也顯示，非遺傳因素，如患者合并高血壓、糖尿病等心血管疾病或者同時使用鈣離子拮抗劑將會降低雙抗治療抗血小板效應(yīng)。Ames等［16］在研究中表明，糖尿病(DM)患者更容易產(chǎn)生阿司匹林抵抗，他們認為盡管阿司匹林抑制了COX-1通路的血小板活化，糖尿病患者體內(nèi)的氧化應(yīng)激仍可能會增強血小板凝血功能。因此，雙抗治療中，盡管阿司匹林和氯吡格雷分別從不同的通路抑制了血小板活化，但糖尿病患者的氧化應(yīng)激反應(yīng)可能抵消了雙抗的抗血小板效應(yīng)，使得研究中觀察到的血小板活化并未減少。Gremmel等［17－18］在研究中指出，行PCI術(shù)的冠心病患者在服用氯吡格雷時若同時服用鈣離子拮抗劑(CCBs)可以抑制氯吡格雷向活性代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，進而抑制其抗血小板聚集功能。本研究也顯示，同時服用CCBs的PCI患者相比單獨使用雙抗治療的患者發(fā)生嚴重不良心臟事件的風險提高約2倍(HR，95%CI:2.686，1.447－4.985)，與前者研究結(jié)果相似。提示非遺傳因素對雙抗治療的預(yù)后有著重要影響。

本研究的結(jié)果僅能說明在目前的控制條件下，PON1基因啟動子區(qū) －108C/T，－126G/C和－162G/A不能成為雙抗治療抗血小板臨床效應(yīng)的獨立預(yù)測因素;而行PCI術(shù)的冠心病患者可以通過控制非遺傳因素，如有效控制合并癥及優(yōu)化合并用藥等方法來有效改善其預(yù)后，減少主要不良心臟事件的發(fā)生。有關(guān)氯吡格雷反應(yīng)性個體差異及PCI術(shù)預(yù)后影響因素的揭示需要更廣泛更深入的研究。

［1］ Shuldiner A R，O’Connell J R，Bliden K P，et al.Association of cytochrome P450 2C19 genotype with the antiplatelet effect and clinical efficacy of clopidogrel therapy［J］.JAMA，2009，302:849－57.

［2］ Mega J L，Close S L，Wiviott S D，et al.Cytochrome P-450 polymorphisms and response to clopidogrel［J］.N Engl J Med，2009，360:354－62

［3］ Bouman H J，Schomig E，van Werkum J W，et al.Paraoxonase-1 is a major determinant of clopidogrel efficacy［J］.Nat Med，2011，17:110－6.

［4］ Zhao L P，Li S S，Khalid1 N.A method for the assessment of disease associations with single-nucleotide polymorphism haplotypes and environmental variables in case-control studies［J］.Am J Hum Genet，2003，72(5):1231－50.

［5］ Lai L Y，Gu Y，Chen J，et al.Production of aldosterone by rat mesangial cell and the accumulation of extracellular matrix induced by aldosteron［J］.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2003，83:1900－5.

［6］ Gorog D A，Sweeny J M，F(xiàn)uster V.Antiplatelet drug'resistance'.Part 2:laboratory resistance to antiplatelet drugs-fact or artifact［J］.Nat Rev Cardiol，2009，6:365－73.

［7］ Sweeny J M，Gorog D A，F(xiàn)uster V.Antiplatelet drug'resistanct'.Part 1:mechanisms and clinical measurements［J］.Nat Rev Cardiol，2009，6:273－82.

［8］ Faraday N，Becker D M，Becker L C.Pharmacogenomics of platelet responsiveness to aspirin［J］.Pharmacogenomics，2007，8: 1413－25.

［9］ Gong I Y，Crown N，Suen C M，et al.Clarifying the importance of CYP2C19 and PON1 in the mechanism of clopidogrel bioactivation and in vivo antiplatelet response［J］.Eur Heart J，2012 in press.

［10］Simon T，Steg P G，Becquemont L，et al.Effect of paraoxonase-1 polymorphism on clinical outcomes in patients treated with clopidogrel after an acute myocardial infarction［J］.Clin Pharmacol T-her，2011，90:561－7.

［11］Reny J L，Combescure C，Daali Y，et al.Influence of the paraoxonase-1 Q192R genetic variant on clopidogrel responsiveness and recurrent cardiovascular events:a systematic review and meta-analysis［J］.Thromb Haemost，2012，10(7):1242－51.

［12］Ancrenaz V，Desmeules J，James R，et al.Paraoxonase-1 pathway is not a major bioactivation pathway of clopidogrel in vitro［J］.Br J Pharmacol，2012，166(8):2362－70.

［13］Regieli J J，Jukema J W，Doevendans P A，et al.Paraoxonase variants relate to 10-year risk in coronary artery disease:impact of a high-density lipoprotein-bound antioxidant in secondary prevention［J］.Am Coll Cardiol，2009，54:1238－45.

［14］Arii K，Suehiro T，Ota K，et al.Pitavastatin induces PON1 expression through p44/42 mitogen-activated protein kinase signaling cascade in Huh7 cells［J］.Atherosclerosis，2009.202:439－45.

［15］Arii K，Suehiro T，Ikeda Y，et al.Role of protein kinase C in pitavastatin-induced human paraoxonase I expression in Huh7 cells［J］.Metabolism，2010，59:1287－93.

［16］ Ames P R，Batuca J R，Muncy I J，et al.Aspirin insensitive thromboxane generation is associated with oxidative stress in type 2 diabetes mellitus［J］.Thromb Res，2012，138(3):350－4.

［17］ Gremmel T，Steiner S，Seidinger D，et al.Calcium-channel blockers decrease clopidogrel-mediated platelet inhibition［J］.Heart，2010，96:186－9.

［18］Siller-Matula J M，Lang I，Christ G，Jilma B.Calcium-channel blockers reduce the antiplatelet effect of clopidogrel［J］.Am Coll Cardiol，2008，52:1557－63.