王 青，王靜鳳，石 迪，徐雷雷，王玉明，薛長(zhǎng)湖

(中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266003)

海參皂苷(holothurian glycosides)，又稱海參素(holothurin)，在鮮品中含量為0.019% ～0.9%，在干品中為0.341%～1.082%。目前已從30多種海參體內(nèi)分離出100多種海參皂苷類成分，它是海參的主要次生代謝產(chǎn)物，多數(shù)為羊毛甾烷型三萜皂苷，具有提高免疫力［1］、抗真菌［2］、保護(hù)肝損傷［3］、抗腫瘤［4－6］等廣泛的藥理活性。革皮氏海參(Pearsonothuria graeffei)屬海參綱(Holothurioider)楯手目(Aspidochirotida)海參科(Holothuriidae)皮氏海參屬(Pearsonothuria)，主要分布在熱帶海域，是一種皂苷含量較高的低值食用海參，其體壁中的皂苷含量較其它海參品種高［1］，可以作為海參皂苷的良好來(lái)源。隨著多種海參皂苷逐漸被發(fā)現(xiàn)，其生物活性也受到越來(lái)越多的關(guān)注。但無(wú)論是海參皂苷還是其它的皂苷，都是強(qiáng)的表面活性劑，對(duì)各種動(dòng)植物細(xì)胞具有廣泛的毒性［7－8］，如大多數(shù)海參皂苷都具有較強(qiáng)的溶血活性［8］，研究還發(fā)現(xiàn)，與海參皂苷同屬三萜類化合物的植物性皂苷對(duì)機(jī)體具有不同程度的毒性作用，其毒性作用主要以肝、腎損傷為主［9］。近年來(lái)有關(guān)海參皂苷安全性評(píng)價(jià)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以革皮式海參總皂苷為研究對(duì)象，從急性毒性實(shí)驗(yàn)、骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)和30d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)3個(gè)方面對(duì)海參皂苷進(jìn)行毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)，以期為海參皂苷的開(kāi)發(fā)應(yīng)用和低值海參的高值化加工利用及深度開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 海參及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 革皮氏海參，購(gòu)于青島南山市場(chǎng)，并經(jīng)中國(guó)科學(xué)院海洋研究所廖玉麟研究員鑒定。健康ICR小鼠，♀♂各半，體質(zhì)量為18～20 g，4周齡，SPF級(jí);健康Wistar大鼠，♀♂各半，體質(zhì)量為90～110 g，SPF級(jí)，均購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(京)2007－0001。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物房環(huán)境溫度為22℃ ～24℃，濕度為52%～58%。

1.2 主要試劑 葡萄糖試劑盒(批號(hào):20110716)，中生北控生物科技有限公司產(chǎn)品;白蛋白試劑盒(批號(hào):20110720)、總蛋白試劑盒 (批號(hào): 20110725)、乳酸脫氫酶試劑盒(批號(hào):20110706)、肌酸激酶試劑盒(批號(hào):20110706)、肌酐試劑盒(批號(hào):20110720)、尿素氮試劑盒(批號(hào):20110720)、尿酸試劑盒(批號(hào):20110720)、谷草轉(zhuǎn)氨酶試劑盒(批號(hào):20110716)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶試劑盒 (批號(hào): 20110716)、總膽固醇試劑盒(批號(hào):20110725)、甘油三酯試劑盒(批號(hào):20110725)，均為南京建成科技有限公司產(chǎn)品;Giemsa染料，上海勁馬生物科技有限公司產(chǎn)品。其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器 酶標(biāo)儀(680型，美國(guó)Bio-Rad公司);高速冷凍離心機(jī)(GL-20M型，上海盧湘離心機(jī)儀器有限公司);全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(XT1800i型，日本Sysmex公司);臺(tái)式離心機(jī)(TGL-16G型，上海安亭科學(xué)儀器廠)，光學(xué)顯微鏡(BH-2型，日本O-lympus公司)。

2 方法

2.1 革皮氏海參總皂苷的制備 用粉碎機(jī)將革皮氏海參干品粉碎，加60%乙醇熱回流抽提6次，合并各次抽提所得上清液，減壓回收乙醇，得水溶液，過(guò)HP-20型大孔樹(shù)脂柱，依次以水、80%乙醇及100%乙醇洗脫，收集80%乙醇洗脫液減壓濃縮，經(jīng)真空冷凍干燥后得到革皮氏海參總皂苷。采用香草醛―冰乙酸比色法［10］測(cè)定，所得革皮氏海參總皂苷的純度為65%。將其于常溫下干燥保存，臨用時(shí)用0.5%羧甲基纖維素配調(diào)。

2.2 急性毒性實(shí)驗(yàn) 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，將健康ICR小鼠隨機(jī)分為正常組和革皮氏海參總皂苷不同劑量組，每組5只。實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水12 h后，劑量組小鼠分別一次性灌胃不同濃度革皮氏海參總皂苷溶液(分別為0.464、1、2.15和 4.64 g·kg－1bw)，正常組灌胃0.5%羧甲基纖維素溶液，灌胃體積為0.01 ml·g－1bw。灌胃后連續(xù)觀察14 d，記錄死亡數(shù)，按照概率單位法［11－12］測(cè)定海參皂苷LD50及95%可信區(qū)間。

2.3 骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn) 健康ICR小鼠，♂♀各半，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組，皂苷低、中、高劑量組，每組5只。陽(yáng)性對(duì)照組灌胃環(huán)磷酰胺(40 mg·kg－1)，各劑量組灌胃不同濃度的海參皂苷溶液(♀分別為138、275和550 mg·kg－1，♂分別為135、270和540 mg·kg－1)，正常對(duì)照組灌胃等體積的0.5%羧甲基纖維素溶液，灌胃體積為0.01 ml·g－1bw。用30 h給受試物法［13］，即第1次灌胃后間隔24 h進(jìn)行第2次灌胃，第2次給受試物后6 h，脫頸椎處死動(dòng)物。取股骨制作骨髓細(xì)胞涂片，經(jīng)甲醇固定、Giemsa溶液染色后，檢查計(jì)數(shù)有微核的PCE，微核率以千分率表示，并計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞中PCE與成熟紅細(xì)胞(NCE)的比值。

2.4 30 d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn) 健康Wistar大鼠，4周齡，♂♀各半，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為正常組，革皮氏海參總皂苷低、中、高劑量組，每組10只。各劑量組分別灌胃不同濃度的革皮氏海參總皂苷溶液(劑量分別為25、50和100 mg·kg－1bw，分別為半數(shù)致死量的3.25%、6.5%和13%)，正常組灌胃0.5%羧甲基纖維素溶液。灌胃體積為0.01 ml·g－1bw，每天1次，連續(xù)30 d。每天觀察和記錄大鼠的活動(dòng)和攝食情況;每3天稱一次體重;實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4 d，大鼠單只入代謝籠收集24 h尿液，并記錄尿液體積，取5 ml尿液離心后取上清，用于尿液中相關(guān)生化指標(biāo)的檢測(cè);實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1 d，大鼠尾靜脈取血，檢測(cè)外周血像各指標(biāo);于末次給藥后，禁食不禁水12 h，大鼠經(jīng)乙醚麻醉，腹主動(dòng)脈取血，7 500 r·min－1離心15 min，分離血清，用于血清生化指標(biāo)的檢測(cè);仔細(xì)剝離心、肝、胃、肺、腎、睪丸、卵巢等器官，經(jīng)10%甲醛固定、石蠟包埋、切片和HE染色，進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。

2.3.1 外周血像的檢測(cè) 采用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀，檢測(cè)血液中白細(xì)胞(white blood cell，WBC)、紅細(xì)胞(red blood cell，RBC)、血小板(platelets，PLT)數(shù)量和血紅蛋白(hemoglobin，Hb)含量。

2.3.2 血糖和血脂的檢測(cè) 參照試劑盒分別測(cè)定血糖和血清中總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)的含量。

2.3.3 肝臟功能指標(biāo)的檢測(cè) 參照試劑盒分別檢測(cè)血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase，ALT)、白蛋白(albumin，ALB)和總蛋白(total protein，TP)的含量。

2.3.4 心肌損傷指標(biāo)的檢測(cè) 參照試劑盒分別檢測(cè)血清中乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)和肌酸激酶(creatine kinase，CK)的含量。

2.3.5 腎臟功能指標(biāo)的檢測(cè) 參照試劑盒分別測(cè)定血清和尿液中尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(creatinine，Cr)和尿酸(uric acid，UA)的含量。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，并以LSD法進(jìn)行兩兩比較。

3 結(jié)果與討論

3.1 急性毒性實(shí)驗(yàn) 急性毒性實(shí)驗(yàn)是毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)第一階段最基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)，據(jù)此可了解受試物對(duì)機(jī)體造成急性損害的可能性、嚴(yán)重程度及毒性性質(zhì)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，給予灌胃2.15、4.64 g·kg－1bw革皮氏海參總皂苷的小鼠和1、0.464 g·kg－1bw革皮氏海參總皂苷的個(gè)別小鼠，變得安靜，活動(dòng)減少，個(gè)別出現(xiàn)抽搐現(xiàn)象，最終呼吸變?nèi)踔敝了劳?。存活小鼠在活?dòng)、攝食、飲水等發(fā)面均正常，實(shí)驗(yàn)結(jié)束解剖動(dòng)物，大體觀察肝、腎、脾、心、肺等主要臟器均未見(jiàn)明顯異常改變，不同劑量組小鼠的死亡數(shù)見(jiàn)Tab 1，根據(jù)概率單位法計(jì)算，革皮氏海參總皂苷對(duì)♀和♂小鼠的LD50分別為1.10和1.08 g·kg－1，根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范(2003年版)》中的急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，屬低毒級(jí)。

3.2 骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn) 結(jié)果見(jiàn)Fig 1和Tab 2。與正常對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組小鼠微核率差異有顯著性;海參皂苷各劑量組的微核率與正常對(duì)照組比較，差異均無(wú)顯著性。提示革皮式海參總皂苷對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核發(fā)生沒(méi)有誘導(dǎo)作用。

3.3 大鼠30 d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

3.3.1 大鼠一般狀況觀察 灌胃革皮氏海參總皂苷30 d，劑量組大鼠精神活躍，運(yùn)動(dòng)性強(qiáng)，毛色光澤，飲食、飲水均正常，與正常組相比較沒(méi)有明顯差異。實(shí)驗(yàn)期間大鼠均無(wú)死亡或異?，F(xiàn)象。

3.3.2 對(duì)大鼠體重的影響 結(jié)果見(jiàn)Tab 2。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，正常對(duì)照組♀♂大鼠體重穩(wěn)步增加;灌胃海參皂苷后，劑量組大鼠體重變化同正常組無(wú)差異。表明海參皂苷對(duì)大鼠體重?zé)o明顯影響。

3.3.3 對(duì)大鼠外周血像的影響 結(jié)果見(jiàn)Tab 3。與正常組相比，劑量組大鼠血液中WBC、RBC、PCT數(shù)量和Hb含量差異均無(wú)顯著性(P＞0.05)。說(shuō)明革皮氏海參總皂苷對(duì)大鼠外周血中各常規(guī)指標(biāo)無(wú)影響。

3.3.4 對(duì)大鼠血糖和血脂的影響 TG和TC是反應(yīng)機(jī)體脂質(zhì)代謝的重要指標(biāo)。與正常組相比較，劑量組血糖、TC和TG差異均無(wú)顯著性(結(jié)果見(jiàn)Tab 4)。提示革皮氏海參總皂苷對(duì)大鼠糖代謝和脂代謝沒(méi)有影響。

3.3.5 對(duì)大鼠肝臟功能的影響 AST和ALT是肝臟功能檢測(cè)的主要指標(biāo)，主要反映肝細(xì)胞有無(wú)受損及嚴(yán)重的程度，當(dāng)肝臟損傷時(shí)，血液中AST和ALT會(huì)升高［14］;ALB、TP主要是反映肝細(xì)胞蛋白合成代謝功能的指標(biāo)，當(dāng)肝功能障礙時(shí)，肝臟合成蛋白質(zhì)含量會(huì)減少。由表5可見(jiàn)，與正常組相比，劑量組血清中AST、ALT、ALB和TP含量差異均無(wú)顯著性(P＞0.05)。提示革皮氏海參總皂苷對(duì)大鼠肝臟功能沒(méi)有產(chǎn)生明顯的毒性作用。

Tab 1 LD50of P.graeffei in mice(n=5)

Tab 2 Results of micronucleus tests of bone marrow PCE cells in mice(n=10)

Tab 3 Effects of saponins of P.graeffei on peripheral hemogram in rats(±s，n=10)

Tab 3 Effects of saponins of P.graeffei on peripheral hemogram in rats(±s，n=10)

Sex Dose/mg·kg－1 WBC/109·L－1 RBC/1012·L－1 PLT109·L－1 Hb/g·L －1 Male 0 9.63±2.45 7.85±0.47 964.33±55.34 160.50±12.30 20 10.10±1.68 7.69±0.67 986.00±65.05 163.70±16.40 50 9.70±1.47 7.85±0.97 966.67±65.72 163.40±18.20 100 9.90±0.60 7.88±0.95 954.50±55.67 164.50±16.90 Female 0 9.23±2.74 7.17±0.77 929.50±83.37 162.50±13.40 20 9.94±1.94 7.43±0.44 971.20±32.18 163.30±31.20 50 9.58±2.39 7.18±0.42 938.50±83.05 161.60±24.20 100 9.66±2.85 7.46±0.28 916.00±23.37 163.50±30.80

Fig 1 Morphologic observation of bone marrow PCE cells in mice

3.3.6 對(duì)大鼠心肌損傷的影響 LDH和CK是心肌胞質(zhì)中的特異性酶，其外漏的程度可間接反映心肌的受損程度［15］。由Tab 6可知，與正常組相比，各劑量組血清中LDH、CK含量差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。提示革皮氏海參總皂苷對(duì)大鼠心肌沒(méi)有產(chǎn)生毒性作用。

Tab 4 Effects of saponins of P.graeffei on blood glucose and lipids in rats(±s，n=10)

Tab 4 Effects of saponins of P.graeffei on blood glucose and lipids in rats(±s，n=10)

Sex Dose/ mg·kg－1 Blood glucose/ mg·L－1 TC/ mmol·L－1 TG/ mmol·L －1 Male 0 7.50±1.80 1.72±0.19 0.24±0.10 20 7.77±1.06 1.66±0.06 0.26±0.02 50 7.64±1.42 1.68±0.21 0.26±0.05 100 7.60±0.24 1.68±0.32 0.24±0.16 Female 0 7.78±1.18 1.79±0.15 0.24±0.14 20 7.81±1.27 1.79±0.07 0.25±0.04 50 7.72±0.99 1.76±0.20 0.26±0.11 100 7.82±0.82 1.77±0.31 0.25±0.01

3.3.7 對(duì)大鼠腎臟功能的影響 BUN、Cr和UA分別為人體蛋白質(zhì)、肌酸和嘌呤代謝產(chǎn)物，3種物質(zhì)均經(jīng)腎小球?yàn)V過(guò)而隨尿液排除體外［16］，是判斷腎功能損害程度的重要指標(biāo)。當(dāng)腎實(shí)質(zhì)受損害時(shí)，腎小球?yàn)V過(guò)率降低，血清中UA、Cr和BUN含量會(huì)升高。從Tab 7看出，與正常組相比，劑量組血清和尿液中Cr、UA、BUN的含量差異均無(wú)顯著性(P＞0.05)。提示革皮氏海參總皂苷對(duì)大鼠腎臟沒(méi)有產(chǎn)生明顯毒性作用。

Fig 2 Effects of saponins of P.graeffei on the body weight in rats

Tab 5 Effects of saponins of P.graeffei on liver function in rats(±s，n=10)

Tab 5 Effects of saponins of P.graeffei on liver function in rats(±s，n=10)

Sex Dose/mg·kg－1 AST/mmol·L－1 ALT/mmol·L－1 ALB/mmol·L－1 TP/mmol·L －1 Male 0 73.13±15.03 25.04±7.42 33.86±2.10 0.72±0.03 20 75.37±1.29 24.70±4.54 33.38±3.74 0.73±0.02 50 75.23±14.73 26.66±4.80 33.96±3.50 0.73±0.03 100 74.79±5.40 25.81±4.91 33.49±2.87 0.73±0.05 Female 0 68.26±5.60 25.44±5.98 33.13±2.67 0.73±0.02 20 69.03±5.46 25.61±7.88 34.73±1.44 0.73±0.03 50 70.51±12.79 26.17±2.05 34.58±0.55 0.72±0.04 100 69.12±4.72 26.56±7.35 33.75±3.43 0.72±0.05

Fig 3 Effects of saponins of P.graeffei on histomorphology in rats

3.3.8 組織病理學(xué)檢查 對(duì)各劑量組大鼠肝、腎、睪丸、卵巢、胃、心、肺等臟器肉眼觀察的結(jié)果表明，與正常對(duì)照組比較，各臟器的顏色和大小正常，均未見(jiàn)明顯滲出、水腫、增生、萎縮等病變。顯微觀察結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，高劑量組大鼠睪丸曲細(xì)精管排列不規(guī)則，直徑有所變大，出現(xiàn)不規(guī)則變形，生精上皮層次減少，間隙增寬，支持細(xì)胞減少，說(shuō)明灌胃高劑量的革皮氏海參總皂苷對(duì)大鼠睪丸有輕微損傷，其它臟器結(jié)構(gòu)均未發(fā)現(xiàn)明顯異常改變。

Tab 6 Effects of saponins of P.graeffei on myocardial function in rats(±s，n=10)

Tab 6 Effects of saponins of P.graeffei on myocardial function in rats(±s，n=10)

Sex Dose/mg·kg－1 LDH/U·L－1 CK/U·L －1 Male 0 3.29±2.32 0.43±0.07 20 3.27±1.02 0.42±0.09 50 3.32±2.26 0.42±0.12 100 3.36±0.37 0.43±0.12 Female 0 3.43±1.12 0.43±0.07 20 3.31±2.22 0.43±0.10 50 3.43±1.23 0.44±0.10 100 3.37±1.12 0.44±0.12

Tab 7 Effects of saponins of P.graeffei on the contents of Cr，UA and BUN of serum in rats(±s，n=10)

Tab 7 Effects of saponins of P.graeffei on the contents of Cr，UA and BUN of serum in rats(±s，n=10)

Sex Dose/mg·kg－1UA/mg·L－1 BUN/mmol·L－1Cr/mmol·L －1 Male 0 87.80±12.14 7.48±1.08 90.70±16.70 20 87.17±17.81 7.61±1.10 89.50±17.78 50 88.27±14.94 7.43±0.55 88.67±15.85 100 89.63±15.28 7.51±1.00 89.67±14.50 Female 0 88.20±10.62 7.51±0.97 90.56±22.32 20 86.60±15.22 7.67±1.24 91.28±14.53 50 87.33±16.92 7.48±0.88 89.33±12.20 100 88.90±16.75 7.41±0.44 88.29±15.78

Tab 8 Effects of saponins of P.graeffei on the levels of UA，BUN and Cr of urine in rats(±s，n=10)

Tab 8 Effects of saponins of P.graeffei on the levels of UA，BUN and Cr of urine in rats(±s，n=10)

Sex Dose/mg·kg－1UA/mg·L－1 BUN/mmol·L－1Cr/mmol·L －1 Male 0 30.50±5.80 29.77±5.00 311.00±34.66 20 30.17±4.06 28.76±5.59 308.60±48.80 50 31.67±6.42 28.91±3.75 306.20±82.79 100 30.17±3.24 28.61±7.81 304.67±79.50 Female 0 30.71±8.28 28.63±2.64 314.50±54.73 20 30.25±3.27 28.94±8.33 308.20±55.57 50 31.33±5.99 28.43±6.91 307.20±68.73 100 29.17±6.82 27.39±3.46 305.20±52.06

睪丸是機(jī)體的生殖和內(nèi)分泌器官，革皮式海參總皂苷對(duì)大鼠睪丸產(chǎn)生毒性作用，可能導(dǎo)致精子存活量下降，畸形率增加，最終造成生殖功能障礙。盡管己知睪丸內(nèi)有大量毒物可能作用的位點(diǎn)，但對(duì)毒物引起睪丸損傷的機(jī)制卻知之甚少［17］。越來(lái)越多的證據(jù)顯示無(wú)論是自發(fā)的(正常精子發(fā)生過(guò)程中的)還是由各種刺激引發(fā)的生精細(xì)胞死亡中，凋亡占據(jù)主導(dǎo)地位［18］。細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)取決于特異性的凋亡前和抗凋亡基因產(chǎn)物，Bcl-2(Bax)家族成員是一組被公認(rèn)的凋亡調(diào)控因子，它們?cè)诩?xì)胞凋亡途徑中構(gòu)成一個(gè)中央樞紐。此外，研究顯示Fas系統(tǒng)也是哺乳動(dòng)物睪丸生精細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者［18］。革皮式海參引起的睪丸毒性作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的研究，革皮氏海參總皂苷對(duì)♀和♂小鼠的LD50分別為1.10和1.08 g·kg－1，屬低毒級(jí);對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核發(fā)生沒(méi)有誘導(dǎo)作用;30 d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，劑量組對(duì)大鼠的體重、外周血像、肝功能、心肌損傷、腎功能無(wú)明顯毒性作用，但對(duì)大鼠睪丸有輕微毒性作用，說(shuō)明其靶器官為睪丸。海參皂苷作為重要的海洋生物活性物質(zhì)逐漸成為研究的重點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)革皮氏海參總皂苷進(jìn)行比較系統(tǒng)的安全性評(píng)價(jià)，為海參皂苷的應(yīng)用提供劑量參考。

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