丁道芳，王 瑧，李曉鋒，徐樂(lè)勤，梁倩倩，王擁軍

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)龍華醫(yī)院脊柱病研究所，上海 200032;2.復(fù)旦大學(xué)腫瘤醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，上海 200433)

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPS cells)最初由日本科學(xué)家于2006年利用病毒載體將Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc 4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的組合轉(zhuǎn)入體細(xì)胞中，使其重編程而得到的類似胚胎干細(xì)胞的一種細(xì)胞［1］。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子Sox2和Oct4是誘導(dǎo)iPS細(xì)胞生成的必要的轉(zhuǎn)錄因子［2］。

iPS細(xì)胞將有希望成為病人治療用靶細(xì)胞來(lái)源，因此其安全性成為首要關(guān)注問(wèn)題，其次效率也是目前研究的重點(diǎn)之一。目前獲得iPS細(xì)胞大多采用病毒的方式，此種方法可以有效的得到iPS細(xì)胞，但同時(shí)由于病毒的引入增加致癌的風(fēng)險(xiǎn)。在此基礎(chǔ)上，出現(xiàn)修飾性Sox2和Oct4蛋白，即在Sox2等基因的C末端加9～11個(gè)精氨酸肽，再將這些蛋白純化或者細(xì)胞的裂解物加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，這些已經(jīng)修飾后的蛋白肽可以直接進(jìn)入細(xì)胞，從而將這些體細(xì)胞轉(zhuǎn)變成iPS細(xì)胞［3－4］。蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式可以規(guī)避這些風(fēng)險(xiǎn)，但這些蛋白的活性及效率也將成為問(wèn)題，亟待解決。在本研究中，采用了目前最高效的蛋白表達(dá)載體和真核細(xì)胞表達(dá)方式，使表達(dá)的蛋白量增加，并對(duì)表達(dá)出的蛋白進(jìn)行通透和促增殖的功能進(jìn)行鑒定，以確定得到的Sox2通透性蛋白具有活性。本文以Sox2基因?yàn)槔芯客ㄍ感缘鞍椎谋磉_(dá)和功能鑒定，為進(jìn)一步得到安全的iPS細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblasts，MEFs)取自懷孕13 d左右孕鼠的胚胎，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均為3代內(nèi)。293T細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中。

1.2 主要儀器、試劑 核酸蛋白凝膠成像系統(tǒng)(天能公司)，熒光倒置顯微鏡(Olympus公司)，蛋白電泳和轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(Biorad公司)。DNA markerⅢ(天根生物公司)，Sox2抗體(Santacruz，美國(guó))，PCNA(Proteintech公司)，GAPDH抗體(CST公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 構(gòu)建重組質(zhì)粒pPYCAG-9R-Sox2 通過(guò)PCR方法在Sox2基因(實(shí)驗(yàn)室保存)的N端加上9個(gè)精氨酸的多肽。9R-Sox2擴(kuò)增用的引物，上游序列為5'CCG AGATCT ATG CGC AGA CGC CGC AGA CGC AGA CGC CGC TAT AAC ATG ATG GAG3'，下游序列為5'AAT CTC GAG TCA CAT GTG CGA CAG GGG CAG3'。擴(kuò)增后的基因序列通過(guò)亞克隆至pPYCAG載體上。在9R-Sox2融合基因的N端和C端分別引入BglII和XhoI酶切位點(diǎn)，經(jīng)酶切后連接至經(jīng)同樣酶切的pPYCAG載體上。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和陽(yáng)性克隆篩選 pPYCAG-9RSox2重組質(zhì)粒4 μg和10 μl脂質(zhì)體2 000分別稀釋于100 μl無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中，5 min后兩者混勻，加入293T細(xì)胞中，4 h細(xì)胞換液，培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM中。由于pPYCAG載體攜帶嘌呤霉素抗性基因，具有嘌呤霉素抗性，根據(jù)這一特性殺死未轉(zhuǎn)染pPYCAG-9R-Sox2重組質(zhì)粒的細(xì)胞。轉(zhuǎn)染72 h后，加嘌呤霉素2 mg·L－1維持至1周。得到表達(dá)9R-Sox2的陽(yáng)性克隆細(xì)胞。對(duì)照為pPYCAG轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞。

1.3.3 細(xì)胞免疫熒光鑒定蛋白表達(dá) 表達(dá)9RSox2的陽(yáng)性克隆細(xì)胞，PBS清洗兩次，4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS漂洗3次，用5%BSA的封閉液(含0.2%Trition X-100)室溫封閉1 h后，加入羊來(lái)源的Sox2抗體(1∶200)，37℃作用2 h，PBS漂洗3次，每次5 min，加入FITC標(biāo)記的抗山羊二抗(1∶200)，避光37℃反應(yīng)1 h，PBS漂洗3次，每次5 min，接著用DAPI染色，室溫5 min，PBS漂洗，熒光顯微鏡觀察拍照。對(duì)照為轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pPYCAG的293T細(xì)胞。

1.3.4 細(xì)胞蛋白提取 收集表達(dá)9R-Sox2的陽(yáng)性細(xì)胞，重懸于裂解液(100 mmol·L－1HEPES，pH 8.2，50 mmol·L－1NaCl，5 mmol·L－1MgCl2，1 mmol·L－1DTT，蛋白酶抑制劑)，直徑10 cm培養(yǎng)皿，細(xì)胞長(zhǎng)滿加300 μl裂解液，冰上放置30 min，超聲裂解，裂解液于4℃，15 000×g離心15 min。取上清液分裝，于－80℃冰箱放置備用。同時(shí)提取轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pPYCAG的293T細(xì)胞的蛋白，作為后續(xù)試驗(yàn)的對(duì)照。

1.3.5 Western blot 12%的聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白，以100V恒壓電泳2 h。經(jīng)200 mA恒流壓轉(zhuǎn)膜2 h，轉(zhuǎn)移目的蛋白至PVDF膜(美國(guó)Millipore公司)，用含5%BSA室溫封閉1 h。用封閉液稀釋一抗至適當(dāng)濃度，4℃孵育過(guò)夜。一抗分別為兔抗PCNA(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)。TBST洗膜3次之后，用紅外標(biāo)記的相應(yīng)二抗室溫孵育2 h。TBST洗膜3次之后，用紅外標(biāo)記的相應(yīng)二抗室溫孵育2 h。TBST洗膜3次，于Odyssey儀器上掃描和分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增9R-Sox2基因及構(gòu)建Ppycag-9RSox2重組子 PCR擴(kuò)增9R-Sox2基因，長(zhǎng)度為987 bp，如Fig 1A。Ppycag-9R-Sox2轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中擴(kuò)增并抽提質(zhì)粒，挑選4個(gè)細(xì)菌克隆抽質(zhì)粒后，酶切鑒定表明9R-Sox2已連接至pPYCAG載體上，如Fig 1B。

Fig 1 Construction of recombinant plasmid pPYCAG-9R-Sox2

2.2 表達(dá)9R-Sox2融合蛋白的陽(yáng)性細(xì)胞克隆篩選和鑒定 pPYCAG-9R-Sox2轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，經(jīng)2 mg·L－1嘌呤霉素篩選1周，細(xì)胞免疫熒光鑒定細(xì)胞9R-Sox2蛋白表達(dá)，所有的細(xì)胞核均標(biāo)記為綠色，說(shuō)明表達(dá)9R-Sox2蛋白(Fig 2A)，DAPI標(biāo)記細(xì)胞核為藍(lán)色熒光(Fig 2B)，F(xiàn)ig A和Fig B融合后，發(fā)生重疊(Fig 2C)，表明9R-Sox2表達(dá)在所有的細(xì)胞核，盡管Sox2前面加了9R短肽，但仍未改變其轉(zhuǎn)錄因子的特性。在對(duì)照細(xì)胞中未見有Sox2表達(dá)(Fig 2A'，2B'和2A'B')。

Fig 2 9R-Sox2 expression in 293T cells

2.3 9R-Sox2細(xì)胞通透和對(duì)成纖維細(xì)胞促增殖效應(yīng) 小鼠成纖維細(xì)胞分為兩組，分別棄去小鼠成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基，加入含9R-Sox2細(xì)胞裂解液和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的細(xì)胞裂解液，37℃培養(yǎng)箱放置1 h，PBS清洗3次以上，一組細(xì)胞用于細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)，一組細(xì)胞加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后檢測(cè)PCNA的表達(dá)量。細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，9R-Sox2已定位于小鼠成纖維細(xì)胞核(Fig 3A，3B，3AB)，表明9RSox2已穿透細(xì)胞細(xì)胞膜進(jìn)入核內(nèi)，對(duì)照組未見Sox2表達(dá)(Fig 3A'，3B'，3A'B')。Western blot結(jié)果顯示，細(xì)胞經(jīng)含9R-Sox2裂解物處理后，PCNA相對(duì)于對(duì)照組表達(dá)明顯上調(diào)。

3 討論

目前對(duì)于體細(xì)胞重編程成iPS細(xì)胞，重編程的效率成為首要需解決的問(wèn)題。解決措施主要有添加TGF-β、MEK和GSK3信號(hào)通路抑制劑和Wnt/βcatenin激活劑而達(dá)到提高重編程的效率［5－8］，但仍通過(guò)病毒的方式得到iPS細(xì)胞，安全性成為主要問(wèn)題。近年來(lái)采用蛋白重編程代替病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式，即表達(dá)具有穿透性的蛋白，加入成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)基中，這些蛋白可直接進(jìn)入細(xì)胞，經(jīng)過(guò)重編程獲得安全可靠的iPS細(xì)胞。在這些研究中，已有原核細(xì)胞表達(dá)重組蛋白，但由于蛋白表達(dá)存在翻譯后修飾，此過(guò)程影響蛋白的活性和其生物學(xué)功能，蛋白的活性影響到其功能的發(fā)揮，也影響到重編程的效率。在此基礎(chǔ)上，采用真核表達(dá)的方式得到活性高的表達(dá)蛋白，但由于表達(dá)系統(tǒng)的低效，蛋白表達(dá)量也會(huì)影響重編程的效率。因此，當(dāng)重編程提高時(shí)，iPS細(xì)胞的安全性存在問(wèn)題;而當(dāng)安全性問(wèn)題解決時(shí)，重編程的效率被降低。針對(duì)這些存在的問(wèn)題，在本課題的研究中，采用目前最高效的蛋白表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)通透性的蛋白并對(duì)其功能進(jìn)行鑒定。

Fig 3 The cell-penetrated function of 9R-Sox2 and its proliferative effect on MEFs

由于Sox2蛋白轉(zhuǎn)錄因子活性特點(diǎn)，可表達(dá)并定位于細(xì)胞核中，而純化的Sox2蛋白即使加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，也不會(huì)穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞核中發(fā)揮作用。通過(guò)多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增小鼠的Sox2基因，同時(shí)在其N端融合了9個(gè)精氨酸短肽，可以自由穿過(guò)細(xì)胞膜，使其具備細(xì)胞穿透功能［9］。擴(kuò)增后的9RSox2基因克隆至高效表達(dá)載體pPYCAG上，此載體具有如下特點(diǎn):最強(qiáng)的融合啟動(dòng)子;在含大T抗原的細(xì)胞中如293T細(xì)胞，隨著細(xì)胞的分裂，此表達(dá)載體不斷的復(fù)制，從而實(shí)現(xiàn)最高效的表達(dá)。

重組質(zhì)粒pPYCAG-Sox2轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，為進(jìn)一步保證所有細(xì)胞表達(dá)9R-Sox2蛋白，細(xì)胞轉(zhuǎn)染后進(jìn)行抗性基因篩選，進(jìn)一步使蛋白表達(dá)量提高。除了蛋白表達(dá)量影響細(xì)胞重編程效率，蛋白的活性也是重要因素之一。對(duì)表達(dá)9R-Sox2蛋白的細(xì)胞裂解，得到的蛋白混合物，對(duì)其進(jìn)行活性和功能的檢測(cè)，加入至成纖維細(xì)胞中，作用1 h后換液，再進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光鑒定，和對(duì)照細(xì)胞相比，經(jīng)過(guò)9R-Sox2蛋白的混合物處理的成纖維細(xì)胞在細(xì)胞核位置有Sox2蛋白存在，表明9R-Sox2蛋白具備穿透功能。Sox2為細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用［10］，對(duì)蛋白混合物處理48 h后的細(xì)胞進(jìn)行增殖的檢測(cè)。增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)僅在增殖的細(xì)胞中合成和表達(dá)，可作為細(xì)胞增殖的可靠的評(píng)價(jià)指標(biāo)［11－12］。PCNA在含9R-Sox2蛋白混合物組表達(dá)明顯上調(diào)，進(jìn)一步說(shuō)明9R-Sox2進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮功能。

本研究在提高蛋白表達(dá)量的同時(shí)，也驗(yàn)證了表達(dá)的蛋白具備細(xì)胞通透及促進(jìn)靶細(xì)胞增殖的功能，為深入研究蛋白重編程提供依據(jù)及細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。

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