黃 成，馬陶陶，李 浩，李政通，章勝朋，鄧子煜，李 俊

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽天然藥物活性研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥三級(jí)實(shí)驗(yàn)室“中藥藥理實(shí)驗(yàn)室”，安徽合肥 230032;2.安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，安徽合肥 230601)

肝纖維化是肝臟對(duì)于各種慢性損傷的修復(fù)反應(yīng)，以細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)在肝臟內(nèi)大量沉積為病理特征。瘦素(leptin)是肥胖基因編碼的肽類激素，具有重要的生理作用。研究顯示，瘦素參與肝纖維化的形成，瘦素致纖維化的機(jī)制與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)密切相關(guān)［1－2］。豹皮樟總黃酮(total flavonoids of Litsea coreana Levl，TFLC)是從藥食同源植物豹皮樟提取的有效部位。前期研究表明，TFLC具有良好的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，對(duì)酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎均具有較好的防治作用［3－4］，對(duì)肝纖維化大鼠具有治療作用［5］。本實(shí)驗(yàn)將在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究TFLC對(duì)CCl4誘導(dǎo)肝纖維化大鼠的預(yù)防作用，并深入探討TFLC對(duì)瘦素、瘦素受體(leptin receptor，Ob-Rb)及TGF-β1/Smads通路蛋白表達(dá)的影響，為TFLC防治肝纖維化提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品與試劑 豹皮樟總黃酮，由本院天然藥物化學(xué)室研制，總黃酮含量＞70%;秋水仙堿購(gòu)于版納藥業(yè)有限公司，臨用前均以0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配成相應(yīng)濃度的混懸液。CCl4，分析純，購(gòu)于汕頭西隴化工廠，臨用前用花生油1∶1稀釋。谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase， AST)、 羥 脯 氨 酸(hydroxyproline，Hyp)測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成生物科技公司。透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)、層粘連蛋白(laminin，LN)、Ⅲ型前膠原氨端肽(procollagenⅢN-terminal peptide，PⅢNP)、Ⅳ型膠原(procollagenase IV，CⅣ)放免試劑盒購(gòu)于北京北方生物技術(shù)研究所。Ⅰ型膠原(collagenⅠ)、TGF-β1、leptin ELISA試劑盒購(gòu)于上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司。TRIzol Reagent購(gòu)于Invitrogen公司。Reverse Transcription System逆轉(zhuǎn)錄試劑盒與PCR試劑盒購(gòu)于Fermentas公司。Ob-Rb、TGFβ1Ⅰ型受體(TGFβR1)、Smad3、β-actin引物序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。小鼠抗Ob-Rb、TGFβR1、Smad3抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗購(gòu)于北京中杉公司;ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)于Pierce公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ♂SD大鼠，體質(zhì)量200～220 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物合格證號(hào):皖醫(yī)實(shí)動(dòng)準(zhǔn)字第01號(hào))。動(dòng)物自由進(jìn)食、飲水，1周后使用。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組與處理 大鼠正常喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組、模型組、給藥組(低劑量組100 mg· kg－1、中劑量組200 mg·kg－1、高劑量組400 mg· kg－1)，每組10只。除正常組外，其余各組每周二、周五皮下注射50%CCl4花生油溶液(1 ml·kg－1)，連續(xù)12周;正常組皮下注射等量的花生油溶液。給藥組于造模第1周起灌胃給予TFLC，每天1次，直至造模結(jié)束;正常組和模型組灌以等量的生理鹽水。第12周末，大鼠禁食12 h，2%戊巴比妥鈉(30 mg· kg－1)麻醉，腹主動(dòng)脈采血，常規(guī)制備血清;留取肝臟組織標(biāo)本，檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

2.2 血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 大鼠取血后室溫靜置1 h，3 000 r·min－1離心15 min，分離血清。檢測(cè)血清中ALT、AST、HA、LN、PⅢNP、CⅣ及Ⅰ型膠原、瘦素、TGF-β1。

2.3 組織學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 肝組織石蠟切片Masson染色觀察形態(tài)學(xué)改變，制備肝勻漿，檢測(cè)肝組織Hyp含量。

2.4 RT-PCR分析Ob-Rb、TGF-βR1、Smad3的mRNA水平 按TRIzol試劑盒說(shuō)明書，提取肝臟組織總RNA，按RT-PCR試劑盒說(shuō)明書，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物序列見Tab 1。以β-actin為內(nèi)參照。PCR反應(yīng)產(chǎn)物置1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行密度掃描，以各擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)β-actin光密度值的比值表示目的基因的相對(duì)量。

2.5 Western blot檢測(cè)肝組織中 Ob-Rb、TGF-βR1、Smad3蛋白水平 取大鼠肝組織100 mg，加入1 ml RIPA組織裂解液(每ml裂解液中加10 μl PMSF)，冰上進(jìn)行組織勻漿，12 000 r·min－1，4℃，離心10 min，取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度。每孔加樣量為20 μg蛋白(濃縮膠電壓80 V，分離膠100 V)。電泳結(jié)束后由半干轉(zhuǎn)儀器將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，電壓20 V，時(shí)間15 min。膜于室溫下以含50 g ·L－1脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉2 h，漂洗后加入一抗(Ob-Rb、TGF-βR1、Smad3)，4℃過(guò)夜。再分別加入與一抗相匹配的二抗，室溫放置1 h。ECL發(fā)光試劑盒顯影，以β-actin為內(nèi)參，分析條帶吸光值。

2.6 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 13.0進(jìn)行單因素方差分析及t檢驗(yàn)處理，等級(jí)資料采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，結(jié)果以±s表示。

3 結(jié)果

3.1 TFLC對(duì) CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠血清ALT、AST、HA、LN、PⅢNP、CⅣ、Ⅰ型膠原及肝組織Hyp的影響 模型組血清ALT、AST水平與正常組比較明顯增加(P＜0.01)，TFLC(200、400 mg· kg－1)明顯降低模型大鼠血清ALT、AST水平(P＜0.05，P＜0.01)，表明TFLC具有肝臟保護(hù)作用(Fig 1a);模型組血清肝纖維化指標(biāo)HA、LN、PⅢNP、CⅣ、CollagenⅠ及肝組織中Hyp與正常組比較明顯增加(P＜0.01)，TFLC(200、400 mg·kg－1)明顯降低模型大鼠血清HA、LN、PⅢNP、CⅣ、CollagenⅠ及肝組織Hyp水平(P＜0.05，P＜0.01)，見Fig 1b、c、d、e;以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TFLC對(duì)肝損傷及肝纖維化大鼠具有預(yù)防作用。

3.2 TFLC對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠病理形態(tài)學(xué)影響 Masson染色結(jié)果顯示，正常組肝組織結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞排列整齊;模型組肝組織有大量膠原纖維沉積，纖維間隔粗大，形成假小葉;TFLC(200、400 mg·kg－1)明顯減輕纖維沉積，纖維間隔變窄，表明TFLC可明顯降低肝纖維化程度(Fig 2)。

Tab 1 Sequences of the primers used in the PCR measurements

3.3 TFLC對(duì) CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠血清Leptin、TGF-β1的影響 模型組瘦素和TGF-β1含量明顯增加(P＜0.01)，TFLC(200、400 mg·kg－1)明顯降低模型大鼠血清瘦素和TGF-β1的含量(P＜ 0.05，P＜0.01)，見Fig 3a、b。

Fig 1 Effects of total flavonoids of Litsea Coreana level on serum alanine transaminase(ALT)，aspartate aminotransferase(AST)，hyaluronic acid(HA)，laminin，procollagenⅢN-terminal peptide(PⅢNP) and procollagenase IV(CIV)，hydroxyproline，Collagen Ι and liver Hyp contents in liver fibrosis rats.Each group consists of 10 rats(ˉx± s)

Fig 2 Photomicrographs of liver sections stained with Masson's trichrome(×200)

3.4 TFLC對(duì)CCl4誘導(dǎo)的模型大鼠Ob-Rb、TGF-βR1、Smad3 mRNA與蛋白表達(dá)的影響 與正常組相比，模型組肝組織中Ob-Rb、TGF-βR1、Smad3 mR-NA及蛋白表達(dá)均明顯增高(P＜0.01)，TFLC(200、400 mg·kg－1)可明顯降低上述各項(xiàng)指標(biāo) (P＜0.05，P＜0.01)，見Fig 4。表明TFLC預(yù)防肝纖維化機(jī)制可能與降低Ob-Rb、TGF-βR1、Smad3表達(dá)有關(guān)。

Fig 3 Effects of total flavonoids of Litsea Coreana level on serum Leptin and TGF-β1 level in liver fibrosis rats.Each group consists of 10 rats(±s)

Fig 4 Effects of total flavonoids of Litsea Coreana level on Ob-Rb，TGF-βR1，Smad3 mRNA and protein level in liver fibrosis rats.mRNA and protein are corrected by β-actin(±s)

4 討論

肝纖維化以ECM的過(guò)度沉積為特征。膠原蛋白、蛋白多糖、非膠原性糖蛋白是構(gòu)成ECM的3大類物質(zhì)［6］。HA是構(gòu)成ECM中蛋白多糖的主要成分，LN為一種重要的糖蛋白，PⅢNP與肝纖維化的程度呈定量的明顯相關(guān)關(guān)系，CⅣ可反映肝細(xì)胞損傷、纖維化程度;Hyp為膠原蛋白特有的氨基酸，在肝組織其含量可反映膠原增生與纖維化程度，Ⅰ型膠原是構(gòu)成膠原蛋白的重要成分［7－8］，以上指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)對(duì)肝纖維化具有重要診斷價(jià)值。本研究中，CCl4誘導(dǎo)肝纖維化大鼠血清HA、LN、PⅢNP、CⅣ、Ⅰ型膠原及肝組織Hyp明顯升高，TFLC(200、400 g ·L－1)可明顯降低血清中升高的HA、LN、PⅢNP、CⅣ、Ⅰ型膠原及肝組織中Hyp水平;病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，TFLC(200、400 mg·kg－1)明顯減輕纖維沉積，纖維間隔變窄;以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TFLC能夠有效預(yù)防CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化。

研究證實(shí):活化的肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)是肝纖維化ECM的主要來(lái)源細(xì)胞。HSC的活化、增殖是肝纖維化的關(guān)鍵事件，這一復(fù)雜的病分子網(wǎng)絡(luò)共同調(diào)控的結(jié)果，TGF-β1是其必需的調(diào)節(jié)因子［9］。在TGF-β1細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路中，Smad蛋白為關(guān)鍵的信號(hào)傳導(dǎo)分子。研究顯示:動(dòng)物肝纖維化往往伴隨血清及組織TGF-β1增加，HSC數(shù)量進(jìn)行性增多，Smad3表達(dá)明顯增高。在纖維化形成過(guò)程中，瘦素可上調(diào)TGF-β1。瘦素具有細(xì)胞因子特性，與細(xì)胞表面的瘦素受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用［10］。Honda等［11］在研究瘦素缺陷的小鼠(ob/ ob)和天然瘦素受體缺陷大鼠(fa/fa)發(fā)現(xiàn)，肝纖維化明顯被抑制，肝臟α1(Ι)前膠原mRNA表達(dá)明顯降低，而且肝內(nèi)TGF-β1和HSC活化也被抑制;如果補(bǔ)充瘦素至生理水平，ob/ob小鼠可出現(xiàn)明顯的肝纖維化，并且肝內(nèi)TGF-β1水平、α1(Ι)前膠原mRNA水平也明顯提高;Leclercq等［12］的研究也得出同樣的結(jié)果。提示瘦素可上調(diào)TGF-β1水平增強(qiáng)肝纖維化的形成［13］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型中，外周血瘦素和TGF-β1含量增高;肝組織中Ob-Rb、TGF-βR1、Smad3 mRNA及蛋白表達(dá)增強(qiáng);而TFLC對(duì)模型大鼠外周血瘦素、TGF-β1含量及組織中TGF-βR1、Smad3、瘦素受體的表達(dá)有明顯的降低作用。以上結(jié)果表明，TFLC預(yù)防肝纖維化的作用機(jī)制可能與下調(diào)瘦素及其受體，抑制TGF-β1/Smad通路有關(guān)。

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