趙小琴，符立梧

(華南腫瘤學(xué)國家重點實驗室，中山大學(xué)腫瘤防治中心，廣東廣州 510060)

腫瘤是一種干細(xì)胞疾病，其發(fā)生、發(fā)展與腫瘤干細(xì)胞有十分密切的聯(lián)系?？朔﨏SCs先天性和獲得性耐藥是目前臨床上治療大多數(shù)具有侵襲性和轉(zhuǎn)移性腫瘤的重大挑戰(zhàn)。

1 干細(xì)胞、側(cè)群細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞

干細(xì)胞(stem cells)是一類未分化的原始細(xì)胞，具有多向分化潛能及自我更新能力。特定條件下，可以分化成不同特定功能的細(xì)胞，形成多種組織和器官。

側(cè)群(side population，SP)細(xì)胞能將進(jìn)入細(xì)胞的熒光染料Hoechst 33342排出胞外，并在熒光顯微鏡下觀察或流式細(xì)胞檢測時表現(xiàn)為不著色或淺著色的細(xì)胞，該特性的形成與跨膜轉(zhuǎn)運蛋白ABCG2的表達(dá)有著密切關(guān)系［1］，并具備干細(xì)胞“永生”和處于靜止?fàn)顟B(tài)的特性。

CSCs是存在于腫瘤中的一小部分具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞群體，通過不對稱性分裂維持自我更新和多向分化潛能，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞不斷增殖，促進(jìn)腫瘤異質(zhì)性和多樣性的形成。CSCs具有很強(qiáng)的抗損傷與轉(zhuǎn)移能力，故可能為腫瘤耐藥、惡性腫瘤治療后復(fù)發(fā)及腫瘤轉(zhuǎn)移的根源。

2 CSCs的生物學(xué)特性

首先，CSCs具有干細(xì)胞的特性，CSCs具有強(qiáng)大的增殖分化潛能;此外具有SP細(xì)胞特性，即通過高表達(dá)ABCG2有效地將化療藥泵出細(xì)胞外，導(dǎo)致腫瘤的耐藥和復(fù)發(fā);與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān);促進(jìn)腫瘤血管的生成。近年來，主要是基于特異的細(xì)胞表面標(biāo)志、SP細(xì)胞特性、懸浮培養(yǎng)、BrdU法和異體移植實驗等方法來分離與鑒定不同腫瘤的CSCs，歸納總結(jié)如Tab 1所示。

Tab 1 Biomarker used for the identification CSCs

CD133+ALDH 2008尤文氏肉瘤［16］ CD133+ 2009骨肉瘤［17］ Oct-4+ 2009 CD133+ 2008 ALDH 2010黑色素瘤［18］ netin+CD133+CD166+ 2007 Bmi-1+ 2007神經(jīng)膠質(zhì)瘤［19］ A2B5+ 2008 CD133+nestin+ 2008 CD133+ 2006喉癌［20］ CD133+ 2007鼻咽癌［21］ cytokine 19+ 2007頭頸部鱗狀細(xì)胞癌［22］ CD44+ 2007 CD44+ALDH 2010膀胱癌［23］ Oct-4+ 2007子宮內(nèi)膜癌［24］ Musashi-1+ 2008 CD133 2009卵巢癌［25］ CD133+ 2008 CD44+CD117+ 2008 CD44+MyD88 2009

其次，CSCs還具有腫瘤細(xì)胞的特性，這是區(qū)別CSCs和正常干細(xì)胞的根本所在。CSCs的染色體核型為多倍體，不同于正常干細(xì)胞的二倍體，并且CSCs在接種后具有高致瘤和高轉(zhuǎn)移的特性。

3 CSCs與耐藥

腫瘤多藥耐藥是導(dǎo)致化療失敗的重要原因。CSCs具有對各種化療藥物的耐受性，就其較為明確的主要耐藥機(jī)制可從niche微環(huán)境、ABC轉(zhuǎn)運蛋白、DNA損傷修復(fù)功能3個方面概括。

3.1 niche微環(huán)境的改變 干細(xì)胞niche是干細(xì)胞生存所必需的一個微環(huán)境，是一個分散的動態(tài)的功能性區(qū)域，是由細(xì)胞－細(xì)胞，細(xì)胞－細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，細(xì)胞－可溶性因子的相互作用，以及細(xì)胞的物理狀態(tài)和幾何約束力組成。niche能保持CSCs自我更新、分化和靜息的功能［26］。鑒于 niche能夠維持 CSCs的活性，破壞 CSCs與niche的相互作用也許能夠克服化療耐藥。

1978年，Schofield［27］首次提出起源于脾集落形成細(xì)胞(spleen colony-forming cells，CFU-S)的定向造血干細(xì)胞與骨髓造血干細(xì)胞相比增殖減慢，此現(xiàn)象歸因于失去了長期支持干細(xì)胞活動的“niche”。在線蟲和果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了體細(xì)胞支持細(xì)胞能夠產(chǎn)生維持種系干細(xì)胞(germline stem cell，GSCs)的必須因子，為“niche”的存在提供了證據(jù)。

Niche中研究比較多的是HH、Wnt、Notch和SCF/c-KIT。正常干細(xì)胞的生存有賴于以上信號途徑的調(diào)控，上述信號通路異常時可能會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖。此外，干細(xì)胞niche能通過為干細(xì)胞提供一些可溶性因子，如:GM-CSF、GMSF、IL-6、VEGF和TGF-β，調(diào)節(jié)化療耐藥表型的表達(dá)。因為其中多種藥物能夠誘導(dǎo)IL-6抑制凋亡。所以以這些可溶性因子為靶點進(jìn)行治療可能抑制CSCs的抗凋亡功能從而提高腫瘤的治療效果。

3.1.1 Wnt信號通路 Wnt信號能夠促進(jìn)干細(xì)胞發(fā)育，調(diào)節(jié)干細(xì)胞成熟以及介導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化、存活、凋亡及細(xì)胞運動，是目前研究最多的信號通路。Wnt/β-catenin信號通路在維持CSCs的數(shù)量和特性如耐藥性、克隆形成能力、體內(nèi)成瘤性等方面起著重要作用，這種作用已在白血病、肝癌、大腸癌、皮膚癌等腫瘤中證實。慢性粒細(xì)胞性白血病(chronic myeloid leukemia，CML)由慢性期轉(zhuǎn)變?yōu)榧毙云跁r，伊馬替尼耐藥與作為Wnt/β-catenin轉(zhuǎn)錄標(biāo)志的核內(nèi)β-catenin的升高相關(guān)［28］。Wnt/β-catenin信號可能在ABCB1/MDR-1轉(zhuǎn)錄過程起重要作用［29］。胚胎干細(xì)胞標(biāo)記物Oct-4，最近被證實其在維持肺癌細(xì)胞的侵襲、克隆形成、耐藥方面有著重要作用，可能為肺癌CSCs的一個重要的分子標(biāo)記。Teng等［30］發(fā)現(xiàn)用氯化鋰激活Wnt/β-catenin信號通路后，肺癌A549細(xì)胞系的增殖、克隆形成、轉(zhuǎn)移以及耐藥性等方面的功能明顯增強(qiáng)，表明Wnt信號可能通過Oct4對肺癌CSCs的特性(如耐藥性等方面)產(chǎn)生重要影響。

Fig 1 The basic concept of a stem cell niche

3.1.2 Hedgehog信號通路 Hedgehog簡稱為HH通路，有研究證明HH信號調(diào)節(jié)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、乳腺癌、胰腺癌、多發(fā)性骨髓瘤、慢性粒細(xì)胞性白血病中的CSCs。HH-Gli信號通路是維持成熟神經(jīng)干細(xì)胞和CD133+神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞增殖和自我更新所必須［31－33］。用跨膜蛋白Smoothened (Smo)抑制劑環(huán)杷明(cyclopamine)或者siRNA阻斷HH-Gli通路，能夠明顯降低神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞自我更新的能力［33］。Liu等［34］發(fā)現(xiàn)在標(biāo)記有CD44+/CD24－/low/Lin-的人乳腺癌干細(xì)胞中HH通路被激活，HH信號和Bmi-1基因共同調(diào)節(jié)人乳腺癌CSCs以及正常干細(xì)胞的自我更新。對伊馬替尼耐藥的 Bcr-Abl+的白血病干細(xì)胞(leukemic stem cells，LSCs)可能導(dǎo)致慢性髓細(xì)胞白血病病人復(fù)發(fā)和耐藥的產(chǎn)生。上調(diào)Smo表達(dá)能激活LSCs中的HH通路，促進(jìn)LSCs增殖，而抑制HH通路后能誘導(dǎo)Bcr-Abl+細(xì)胞凋亡，減少LSCs，提示抑制Smo可能有效抑制對伊馬替尼耐藥的LSCs增殖［35］。HH通路的激活可促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤干細(xì)胞生長，而不影響其分化;阻斷HH通路則顯著抑制多發(fā)性骨髓瘤干細(xì)胞克隆增殖。研究還發(fā)現(xiàn)［36］沉默p70S6K2可降低Gli基因的活性，引起HH通路活性降低，同時伴隨細(xì)胞活性的明顯下降?？梢酝茢?，抑制p70S6K2可以下調(diào)HH/Gli通路，從而影響干細(xì)胞的擴(kuò)增，成為非小細(xì)胞肺癌的治療靶點之一。

3.1.3 Notch信號通路 在乳腺癌中，ESA+/CD44+/ CD24low的或者抗凋亡的CSCs的活性受Notch-4受體信號通路的特定調(diào)控。p66Shc基因是通過在缺氧環(huán)境下誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞所鑒定出來，能控制干細(xì)胞調(diào)節(jié)基因Notch-3的表達(dá)。p66Shc/Notch-3相互作用能調(diào)節(jié)乳腺干細(xì)胞或者祖細(xì)胞的自我更新和低氧環(huán)境下的生存率［37］。GSIs是一種Notch-4單克隆抗體，能夠明顯降低乳腺原位導(dǎo)管癌形成球囊(即微球體，是干細(xì)胞樣細(xì)胞的指標(biāo)之一)的能力。在腦腫瘤中，阻斷Notch信號通路能明顯抑制CD133+細(xì)胞和SP細(xì)胞的生長。在干細(xì)胞樣細(xì)胞中Notch信號明顯高于普通細(xì)胞，推斷這些細(xì)胞對Notch信號通路的阻斷劑可能更加敏感［38］。GSIs通過阻斷 Notch信號通路，降低增殖，增加AKT、STAT3磷酸化降低導(dǎo)致的凋亡，降低標(biāo)記有CD133、nestin、Bmi1和Olig2的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞的生存率。

3.1.4 SCF-/c-KIT信號途徑 干細(xì)胞因子(stem cell factor，SCF)又稱為KIT配體，是由骨髓微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的一種酸性糖蛋白。相對于非腫瘤細(xì)胞，CSCs表達(dá)c-KIT并分泌SCF。SCF與其他細(xì)胞因子一起誘導(dǎo)干/祖細(xì)胞動員、增殖，延長其存活時間。Levina等［39］發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中CSCs具有高致瘤性、高轉(zhuǎn)移和惡性度高的特性，這與其高效的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)和特定的信號通路有關(guān)，阻斷SCF-c-KIT信號能夠抑制由化療引起的CSCs增殖和存活，提示抑制SCF-c-KIT信號可能會提高非小細(xì)胞肺癌化療的療效。

除此之外，F(xiàn)unayama等［40］將白血病細(xì)胞系TF-1和間質(zhì)細(xì)胞MS-5共培養(yǎng)后，產(chǎn)生了類似于白血病CSCs niche的一個區(qū)域，使得白血病CSCs對阿糖胞苷、依托泊苷和柔紅霉素的耐藥性增強(qiáng)。白血病CSCs耐藥性的增強(qiáng)主要是通過增加細(xì)胞在G0/G1期的比例，促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白的上調(diào)以及增加Bcl-2的水平，而不影響B(tài)AX或者藥物轉(zhuǎn)運蛋白ABCG2和ABCB1的表達(dá)。纖維連接因子受體VLA-4(α4β1整和素)的抗體能夠阻斷腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)移niche的聯(lián)系［41］，并且在急性白血病模型中能夠降低微小殘留病灶的發(fā)生率。含大量透明質(zhì)酸的底物能夠保護(hù)造血干細(xì)胞抵抗5-Fu的細(xì)胞毒作用，而抗CD44抗體能夠減少急性白血病模型中微小殘留病灶［42］。因此，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和葡糖胺聚糖能夠影響干細(xì)胞的特性，可用于抗CSCs治療。

3.2 ABC轉(zhuǎn)運蛋白 人類基因組包含49種ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因(ATP-binding cassette transporter，ABC transporter)，其中P-糖蛋白(P-gp/ABCB1)、乳腺癌耐藥相關(guān)蛋白(BCRP/ABCG2)、ABCA3和多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance associated proteins，MRPs)與腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥有關(guān)。ABC基因家族的過表達(dá)是保護(hù)干細(xì)胞的主要機(jī)制之一，早先發(fā)現(xiàn)P-gp的耐藥機(jī)制與細(xì)胞對藥物攝入量的減少有關(guān)，而攝入的減少是由一種能量依賴性的主動外排機(jī)制引起的。研究證實［43］ABCG2與SP細(xì)胞的干細(xì)胞成分直接相關(guān);過表達(dá)BCRP的不同細(xì)胞系也表現(xiàn)出對一系列抗癌藥物的耐藥性。CSCs可能原發(fā)性地對許多標(biāo)準(zhǔn)治療不敏感，并且能夠在細(xì)胞毒藥物和靶點藥物治療后存活，最終導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。另外，ABC轉(zhuǎn)運蛋白可能通過外排重要的轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞分化因子來調(diào)節(jié)干細(xì)胞的活動［44］。表達(dá) BCRP和 P-gp的CSCs能特異性外排化療藥物，從而導(dǎo)致耐藥。其中，表達(dá)P-gp的CSCs能外排長春堿和紫杉醇，而表達(dá)BCRP的CSCs能抑制伊馬替尼、拓?fù)涮婵岛图装钡实姆e累。朱言亮等通過對人肺腺癌細(xì)胞株SPC-A1及其多西他賽耐藥株SPC-A1/ Docetaxel兩者的SP細(xì)胞的含量及其生物學(xué)特性、ABC轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)及其對多西他賽耐藥性影響的比較，發(fā)現(xiàn)SPCA1-SP細(xì)胞基本具備了腫瘤干細(xì)胞的特性，而且BCRP表達(dá)也是SPC-A1-SP細(xì)胞多西他賽耐藥的一個主要因素。Sung等［45］也發(fā)現(xiàn)ABCG2表達(dá)對肺A549細(xì)胞系SP表型的多藥耐藥起重要作用。白血病的SP細(xì)胞里富集CSCs，具有很強(qiáng)的將化療藥物如多柔比星和米托蒽醌泵出細(xì)胞的能力，提示增強(qiáng)的藥物外排能力可導(dǎo)致白血病CSCs耐藥。成神經(jīng)瘤CSCs也能外排米托蒽醌，故其存活率高于成神經(jīng)瘤細(xì)胞［46］。

總之，ATP轉(zhuǎn)運依賴性的CSCs在形成腫瘤時相對普遍存在，將來應(yīng)考慮聯(lián)合應(yīng)用其它識別和針對CSCs的靶向藥物進(jìn)行聯(lián)合化療。表2為ABC家族在腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞中表達(dá)情況及其底物的簡要總結(jié)歸納(見Comment in The ABC of glycosylation.［Nat Rev Cancer.2010］)。

3.3 DNA修復(fù) 在自我更新或者DNA修復(fù)的過程中，干細(xì)胞可能通過減少細(xì)胞凋亡或者產(chǎn)生基因突變對化療產(chǎn)生耐藥性，因此導(dǎo)致化療耐藥和治療失敗。腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞具有更強(qiáng)的DNA修復(fù)能力。DNA修復(fù)蛋白O6-methyl guanine-DNA methyltrans-ferase(MGMT)也稱為O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase(AGT)，能夠恢復(fù)6-氧烷基鳥嘌呤堿基結(jié)構(gòu)的完整性，因此能抵抗6-氧烷化劑的細(xì)胞毒性。神經(jīng)膠質(zhì)瘤中MGMT表達(dá)水平的增加與卡莫司汀和替莫唑胺耐藥密切相關(guān)。神經(jīng)膠質(zhì)瘤中CD133+的SP細(xì)胞中，MGMT的表達(dá)較CD133-細(xì)胞高出30多倍，導(dǎo)致對替莫唑胺的耐藥性增強(qiáng)［47］。

在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞中，抑制MEK能夠降低MDM2的表達(dá)，而在抑制MEK或者M(jìn)DM2時導(dǎo)致p53的激活，同時伴有依賴于p53的MGMT表達(dá)的下調(diào);另一方面，抑制MEK能恢復(fù)耐藥的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞對替莫唑胺的敏感性，MEK抑制劑與替莫唑胺聯(lián)合用藥時能有效地抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞的致瘤能力。由此推斷靶向MEK-ERK-MDM2-p53通路聯(lián)合應(yīng)用替莫唑胺將會是一種新的有前途的治療策略［48］。

Tab 2 Selected ABC transporters，their expression in CSCs and chemotherapeutics

Fig 2 Cancer stem cell pathway-derived chemoresistance

3.4 其他機(jī)制 其他機(jī)制也參與調(diào)節(jié)CSCs的耐藥性。例如CD133+的結(jié)腸癌CSCs細(xì)胞中白細(xì)胞介素4(interleukin-4，IL-4)表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致凋亡減少，而用抗體阻斷IL-4后使對氟尿嘧啶和奧沙利鉑耐藥的結(jié)腸CSCs重新變得敏感［49］。

肺癌CSCs中Hsp27在應(yīng)用過氧化物和傳統(tǒng)化療之后活性增加，而用化療藥物的同時阻斷Hsp27的表達(dá)會降低原本對傳統(tǒng)化療耐藥的肺CSCs的存活率，表明Hsp27是導(dǎo)致肺CSCs耐藥的重要原因［50］。Hermann等［51］在胰腺癌中發(fā)現(xiàn)CD133+的CSCs具有高致瘤性，對標(biāo)準(zhǔn)化療方案很高的耐藥性。Ma等［52］認(rèn)為肝細(xì)胞癌的CSCs通過表達(dá)AKT/PKB通路相關(guān)的生存蛋白從而對多柔比星和氟尿嘧啶產(chǎn)生耐藥。神經(jīng)膠質(zhì)瘤CSCs對替莫唑胺、卡鉑、依托泊苷和紫杉醇耐藥，其機(jī)制可能是通過高表達(dá)BCRP、MGMT、抗凋亡蛋白以及凋亡蛋白家族抑制劑［53］。在白血病CSCs中分子代謝調(diào)節(jié)劑ALDH1活性增加，導(dǎo)致對環(huán)磷酰胺等化療藥物的耐藥，而在乳腺癌CSCs中ALDH1的表達(dá)與預(yù)后較差明顯相關(guān)，提示CSCs對化療藥物的耐藥機(jī)制會直接影響病人的預(yù)后。急、慢性髓性白血病CSCs處于相對靜止的狀態(tài)，而化療對處于增殖期的細(xì)胞更敏感。此外，CSCs的不對稱性分裂紊亂可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞過度增殖和耐藥。

4 結(jié)語與展望

CSCs具有自我更新的特性，其自我更新過程的失調(diào)很可能是腫瘤發(fā)生的原因。只有消除CSCs才有可能解決腫瘤治療的耐藥問題，提高療效，達(dá)到治愈腫瘤的目的。目前無論是傳統(tǒng)的化療還是現(xiàn)有的靶向治療措施尚無法徹底清除CSCs，以致發(fā)生耐藥和腫瘤復(fù)發(fā)，因此，清除CSCs及其依賴的信號傳導(dǎo)通路已成為預(yù)防耐藥的一個重要方向。雖然對CSCs的研究還處于初級階段，但干細(xì)胞理論開闊了治療腫瘤、預(yù)防耐藥的思路，對于腫瘤治療的基礎(chǔ)理論研究的深入拓展和臨床實踐都具有積極的意義。

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