唐瑋，李鍵，陳軍，楊晟

中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所 中國(guó)科學(xué)院合成生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032

通過優(yōu)化啟動(dòng)子調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄水平，疏通限速步驟，可達(dá)到提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量的目的[1-2]。但是利用強(qiáng)啟動(dòng)子并不一定有效，因?yàn)橐恍┠康幕虻谋磉_(dá)產(chǎn)物或中間代謝產(chǎn)物可能對(duì)菌體有毒性，從而抑制菌體生長(zhǎng)[3-4]，例如有研究表明在大腸桿菌中過表達(dá)編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的基因pck會(huì)給菌體生長(zhǎng)帶來負(fù)擔(dān)[5]；并且因?yàn)榇蠖鄶?shù)的生物過程都是由多個(gè)基因相互影響的，很難通過調(diào)控一個(gè)基因得到最優(yōu)化的途徑。利用不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子與不同基因的組合表達(dá)可以獲得性狀最優(yōu)的組合[6]。大腸桿菌是常用的異源表達(dá)宿主[7]，已有前人通過易錯(cuò)PCR獲得了不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子可用于途徑優(yōu)化，Alper和Braatsch等人構(gòu)建了一系列不同強(qiáng)度的組成型啟動(dòng)子，其中 Alper系列包括強(qiáng)啟動(dòng)子 Alper PLTetO1和弱啟動(dòng)子Alper BB等，Alper PLTetO1的啟動(dòng)子強(qiáng)度是Alper BB的兩倍[8]，Braatsch系列包括強(qiáng)啟動(dòng)子Braatsch 20和弱啟動(dòng)子Braatsch 10等，Braatsch 20的啟動(dòng)子強(qiáng)度是Braatsch 10的兩倍[9]，可以利用這些不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子與途徑中不同的基因進(jìn)行組合，通過檢測(cè)產(chǎn)物獲得最優(yōu)化的菌株。

傳統(tǒng)工業(yè)上利用丙酮丁醇梭菌生產(chǎn)丁醇[10-11]，近年來通過大腸桿菌異源合成丁醇成為研究熱點(diǎn)[12-13]。丁醇合成途徑中相關(guān)的有編碼硫解酶的thlA基因、bcs-operon以及醛/醇脫氫酶基因adhE1和adhE2。其中的bcs-operon由基因crt、bcd、etfAB、hbd組成，分別編碼巴豆酸酶、丁酰輔酶 A脫氫酶，負(fù)責(zé)電子轉(zhuǎn)移的黃素蛋白亞基，β-羥-丁酰輔酶A脫氫酶。有文獻(xiàn)報(bào)道了ter基因編碼的反式-2-烯酰輔酶 A還原酶 (trans-2-enoyl-CoA reductase)，可以通過不可逆的反應(yīng)為代謝流提供驅(qū)動(dòng)力，替代丙酮丁醇梭菌來源bcd和etfAB可疏通大腸桿菌丁醇合成途徑[14]。本研究用ter基因代替了bcd和etfAB構(gòu)建了優(yōu)化的bcs-operon (包括 crt、ter和 hbd基因，簡(jiǎn)稱operon)。由于大腸桿菌內(nèi)源的醇脫氫酶能夠用于丁醇的合成[15]，本研究將強(qiáng)啟動(dòng)子 Alper PLTetO1或弱啟動(dòng)子 Alper BB，強(qiáng)啟動(dòng)子Braatsch 20或弱啟動(dòng)子Braatsch 10分別與 thlA，operon進(jìn)行組合，用DNA assembler方法[16]快速組裝丁醇合成途徑，獲得最優(yōu)的啟動(dòng)子組合的大腸桿菌丁醇生產(chǎn)菌株。這種啟動(dòng)子優(yōu)化方法也可以在其他的途徑優(yōu)化中得到廣泛的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌Top10，酵母菌株BY4742和質(zhì)粒pYES2均為本實(shí)驗(yàn)室保藏，pLY15質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保藏，pMD18-T simple購(gòu)自TaKaRa公司，啟動(dòng)子序列由GeneScript公司合成。

1.2 酶和試劑

限制性內(nèi)切酶購(gòu)自寶生物公司和Fermentas；質(zhì)粒DNA小量試劑盒、PCR純化試劑盒和DNA膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen，酵母質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自索萊寶生物公司；瓊脂購(gòu)自上海捷倍思生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。PCR反應(yīng)使用的耐熱DNA聚合酶為Taq (MBI Fermentas) 或者KOD (Toyobo)。

1.3 培養(yǎng)基

大腸桿菌培養(yǎng)使用 LB (Luria-Bertani) 培養(yǎng)基：胰化蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g溶于1 L蒸餾水中，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

酵母培養(yǎng)使用 YPD (Yeast extract peptone dextrose) 培養(yǎng)基：1%酵母提取物，2%胰化蛋白胨，2%葡萄糖，如果配成固體的再加2%的瓊脂，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，其中葡萄糖需要單獨(dú)滅菌。

酵母轉(zhuǎn)化子篩選使用基本鹽培養(yǎng)基(SC-ura3)：1) 酵母基本氮源 (Yeast nitrogen base，YNB，無氨基酸或硫酸銨)：0.34 g，硫酸銨：1 g，YNB+硫酸銨溶于50 mL ddH2O中，單獨(dú)滅菌。2) 葡萄糖：4 g (溶于100 mL ddH2O中配成40%的溶液，單獨(dú)滅菌。3) 瓊脂4 g (溶于48 mL的ddH2O中單獨(dú)滅菌)。4) 需要添加的氨基酸配成100×的母液，過濾除菌：12 mg組氨酸(His)，18 mg賴氨酸 (Lys)，60 mg亮氨酸 (Leu)，溶于6 mL的ddH2O中，過濾除菌。在上述物品滅菌后，稍微冷卻一下，將 YNB、硫酸銨和葡萄糖都加入液體瓊脂中，再加入2 mL的過濾除菌的氨基酸混合液，倒板。

TB發(fā)酵培養(yǎng)基 (500 mL)：1) 將下列組分溶解在300 mL ddH2O中：蛋白胨6 g，酵母提取物12 g，甘油2 mL。各組分溶解后高壓滅菌，冷卻到 60 ℃。2) 將 1.155 g的KH2PO4和 8.215 g K2HPO4溶在足量的 ddH2O 中，使終體積為100 mL。高壓滅菌。3) 將10 g葡萄糖溶于100 mL ddH2O中，將3種溶液混合均勻。

1.4 方法

1.4.1 根據(jù)啟動(dòng)子和基因設(shè)計(jì)合適的RBS (核糖體結(jié)合位點(diǎn)) 序列

利 用 在 線 網(wǎng) 站 (https://salis.psu.edu/ software/forward) 設(shè)計(jì)最優(yōu)的RBS序列。

1.4.2 設(shè)計(jì)同源臂引物

利用pLY15 (含有丁醇合成途徑基因thlA以及operon) 質(zhì)粒和人工合成的啟動(dòng)子為模板，設(shè)計(jì)同源臂，引物如表1所示。

1.4.3 制備啟動(dòng)子片段和丁醇合成途徑的片段

用引物WA-BB-U和WA-BB-TLA-D擴(kuò)增弱啟動(dòng)子片段Alper BB-RBS，引物SA-PLTetO1-U和SA-PLTetO1-TLA-D擴(kuò)增強(qiáng)啟動(dòng)子片段Alper PLTetO1-RBS，引物WB-10-U和WB-10-CRT-D擴(kuò)增弱啟動(dòng)子片段 Braatsch 10-RBS，引物SB20-U 和 SB20-CRT-D 擴(kuò)增強(qiáng)啟動(dòng)子片段Braatsch 20-RBS。

用引物TLA-SA-U和TLA-SB-D擴(kuò)增帶有強(qiáng)啟動(dòng)子與強(qiáng)啟動(dòng)子組合的同源臂的 thlA片段(S-thlA-S)，引物TLA-SA-U和TLA-WB-D擴(kuò)增帶有強(qiáng)啟動(dòng)子弱啟動(dòng)子組合的同源臂的 thlA片段 (S-thlA-W)，引物TLA-WA-U和TLA-SB-D擴(kuò)增帶有弱啟動(dòng)子強(qiáng)啟動(dòng)子組合的同源臂的thlA片段 (W-thlA-S)，引物 TLA-WA-U 和TLA-WB-D擴(kuò)增帶有弱啟動(dòng)子與弱啟動(dòng)子組合的同源臂的 thlA片段 (W-thlA-W)，引物CRT-SB-U和HBD-pYES2-D 擴(kuò)增帶有強(qiáng)啟動(dòng)子同源臂的 operon 片段 (S-operon)，引物CRT-WB10-U和HBD-pYES2-D擴(kuò)增帶弱啟動(dòng)子同源臂的operon片段 (W-operon)，KOD酶擴(kuò)增，PCR條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，68 ℃延2 min，35個(gè)循環(huán)；68 ℃延伸10 min，16 ℃保溫10 min。

表1 本研究所用的引物Table 1 Primers used in the study

1.4.4 組建不同強(qiáng)度啟動(dòng)子的丁醇合成途徑

用 EcoRⅠ酶切酵母-大腸桿菌穿梭載體pYES2 (氨芐抗性)，回收線性化載體，回收Alper PLTetO1-RBS、AlperBB-RBS、Braatsch 20-RBS、Braatsch 10-RBS、S-thlA-S，S-thlA-W、W-thlA-S、W-thlA-W、S-operon、W-operon片段，進(jìn)行不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子和片段的組裝，構(gòu)建4種不同強(qiáng)度組合的質(zhì)粒，如表2所示。

1.4.5 轉(zhuǎn)化酵母BY4742

將構(gòu)建4種質(zhì)粒所需的回收片段進(jìn)行混合，用核酸定量?jī)x進(jìn)行定量，載體片段約500 ng，其他片段為300 ng，用真空濃縮儀濃縮到4 μL，電轉(zhuǎn)化酵母菌株BY4742[16]，電擊條件：電壓1.5 kV，電容 25 μF，電阻 200 ?，菌液涂布在SC-ura3的篩選板上，置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~4 d會(huì)出現(xiàn)白色的明顯菌落。

1.4.6 質(zhì)粒PCR驗(yàn)證

挑取明顯的酵母菌落，用酵母試劑盒提取酵母質(zhì)粒，進(jìn)行質(zhì)粒PCR驗(yàn)證thlA以及operon片段。

1.4.7 酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 Top10以及質(zhì)粒的酶切驗(yàn)證

利用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化構(gòu)建的質(zhì)粒到大腸桿菌 Top10中，用質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒后用Hind Ⅲ進(jìn)行酶切驗(yàn)證。

表2 不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子與片段的組合Table 2 Combination of different promoters and fragments

1.4.8 丁醇含量測(cè)定

發(fā)酵方法：96孔板深孔發(fā)酵，培養(yǎng)基為TB發(fā)酵培養(yǎng)基，在微好氧、30 ℃的條件下發(fā)酵100 h。

丁醇含量測(cè)定條件：取上述樣品清液0.2 mL與0.8 mL內(nèi)標(biāo)液混勻，以配置有Grace公司產(chǎn)品ECTM-WAX毛細(xì)管色譜柱的安捷倫公司 7890型氣相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。進(jìn)樣量1 mL，分流比25∶1。分析條件為：柱溫85 ℃，氮?dú)?4.5 kPa.，5.5 min后，升溫至150 ℃；氮?dú)?06.85 kPa，保持3 min，氫氣30 mL/min，空氣400 mL/min，尾吹25 mL/min；進(jìn)樣區(qū)溫度250 ℃，氫火焰檢測(cè)區(qū)溫度為300 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 設(shè)計(jì)最優(yōu)RBS序列

根據(jù)啟動(dòng)子和基因的組合設(shè)計(jì)最優(yōu)的 RBS序列，結(jié)果如表3所示。

2.2 制備片段和線性化載體

擴(kuò)增啟動(dòng)子 AlperPLTetO1-RBS、AlperBBRBS、Braatsch 20-RBS、Braatsch 10-RBS和丁醇合成途徑相關(guān)基因片段 S-thlA-S、S-thlA-W、W-thlA-S、W-thlA-W、S-operon、W-operon，用EcoRⅠ酶切載體 pYES2，獲得的片段純化后電泳圖譜如圖1所示。

2.3 不同啟動(dòng)子強(qiáng)度的質(zhì)粒構(gòu)建

將純化片段混合濃縮電轉(zhuǎn)酵母BY4742，用DNA assembler方法組裝不同強(qiáng)弱啟動(dòng)子組合的質(zhì)粒pTY02、pTY03、pTY04和pTY05。提取酵母質(zhì)粒進(jìn)行質(zhì)粒PCR，確定質(zhì)粒的正確性。如圖2和圖3所示，證明thlA和operon片段同時(shí)存在于構(gòu)建的質(zhì)粒上。

表3 Alper系列和Braatsch系列的啟動(dòng)子序列以及最優(yōu)RBS序列Table 3 Sequence of promoter and RBS

圖1 利用設(shè)計(jì)的含有同源臂的引物PCR擴(kuò)增啟動(dòng)子和丁醇合成途徑基因Fig. 1 Amplification of promoter and butanol biosynthesis genes with the design of the containing homologous arm primer. 1: Alper PLTetO1-RBS; 2: AlperBB-RBS; 3: S-thlA-S; 4: S-thlA-W; 5: W-thlA-S; 6: W-thlA-W; 7: Braatsch 20-RBS; 8: Braatsch 10-RBS; 9: S-operon; 10: W-operon; 11: linear vector pYES2; M: DNA marker.

2.4 反轉(zhuǎn)大腸桿菌后質(zhì)粒Hind Ⅲ酶切驗(yàn)證

將酵母質(zhì)粒反轉(zhuǎn)大腸桿菌Top10后，抽提大腸桿菌質(zhì)粒用Hind Ⅲ進(jìn)行酶切驗(yàn)證。結(jié)果見圖4，證明質(zhì)粒構(gòu)建正確。

2.5 發(fā)酵丁醇產(chǎn)量測(cè)定

挑取驗(yàn)證正確的大腸桿菌，利用 96孔板發(fā)酵100 h，用氣相色譜測(cè)定丁醇產(chǎn)濃度，結(jié)果如圖5所示，證明pTY03組合的質(zhì)粒產(chǎn)丁醇濃度最高，達(dá)到28 mg/L，是其他啟動(dòng)子組合的3~5倍。

圖2 質(zhì)粒PCR驗(yàn)證組裝的4種質(zhì)粒的thlA片段Fig. 2 Identification of thlA fragment by PCR. 1: pTY02; 2: pTY03; 3: pTY04; 4: pTY05; NC: negative control; M: DNA marker.

圖3 質(zhì)粒PCR驗(yàn)證組裝的4種質(zhì)粒的operon片段Fig. 3 Identification of operon fragment by PCR. 1: pTY02; 2: pTY03; 3: pTY04; 4: pTY05; NC: negative control; M: DNA marker.

圖4 Hind Ⅲ酶切驗(yàn)證丁醇途徑組裝質(zhì)粒Fig. 4 Identification of butanol way assembly plasmid by enzyme digestion.

圖5 含有 4種組合的質(zhì)粒的大腸桿菌 Top10發(fā)酵100 h后的丁醇情況Fig. 5 Four different combination plasmids fermentation results by Escherichia coli Top 100 after 100 h. NC: negative control.

3 討論

生物代謝途徑很少由一個(gè)基因控制，大多都是通過多個(gè)基因的相互作用[17]，所以代謝工程改造需要平衡代謝流以獲得最優(yōu)的效果[18-19]。通過強(qiáng)啟動(dòng)子提高轉(zhuǎn)錄水平不一定能獲得最優(yōu)的目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量，甚至?xí)种扑拗鞯纳L(zhǎng)。而通過不同強(qiáng)度啟動(dòng)子的精細(xì)調(diào)控可以更好地平衡多個(gè)基因的相互作用，獲得最優(yōu)的結(jié)果。本研究利用DNA assembler方法快速組裝了不同強(qiáng)度啟動(dòng)子組合的丁醇合成途徑。DNA assembler是一種利用酵母的高同源重組效率[20]從而把目的片段一次性在酵母體內(nèi)進(jìn)行組裝的方法，耗時(shí)短，效率高，避免了傳統(tǒng)的酶連技術(shù)所需的酶切連接等步驟，同時(shí)解除了酶切位點(diǎn)對(duì)操作的限制[21-22]，更加符合合成生物學(xué)日益發(fā)展的需要[23]。但是進(jìn)行組裝的片段不能出現(xiàn)較長(zhǎng)的相同序列，以免發(fā)生重組，引起片段缺失。本研究在梭菌天然生產(chǎn)丁醇的途徑基礎(chǔ)上進(jìn)行改造，利用大腸桿菌啟動(dòng)子庫(kù)，優(yōu)化RBS序列，將thlA基因以及構(gòu)建的優(yōu)化的 operon基因與不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子進(jìn)行組合，根據(jù)最后的發(fā)酵結(jié)果可以看出 pTY03質(zhì)粒丁醇含量最高，達(dá)到28 mg/L，與其他的啟動(dòng)子組合相比丁醇產(chǎn)量提高了3~5倍。這可能是因?yàn)閠hlA是整個(gè)途徑中的第一步，thlA的強(qiáng)轉(zhuǎn)錄保證了前體的供應(yīng)充足，而丁醇的產(chǎn)生會(huì)給宿主帶來負(fù)擔(dān)，甚至影響宿主的生長(zhǎng)，用弱啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄后續(xù)丁醇合成操縱子相對(duì)更好地平衡了代謝流，達(dá)到最好的效果。另外，由于同一個(gè)operon上的3個(gè)基因表達(dá)強(qiáng)度不一定一致，我們可以通過將operon上的基因進(jìn)行重排，或者用單順反子的形式進(jìn)行基因的進(jìn)一步細(xì)化表達(dá)。除啟動(dòng)子優(yōu)化外，還有一些常用于提高異源表達(dá)產(chǎn)物量的方法[24]：1) 敲除副產(chǎn)物途徑和競(jìng)爭(zhēng)途徑的基因，將代謝流盡可能引向目標(biāo)產(chǎn)物[25]；2) 考慮異源表達(dá)的酶之間的相互作用，通過酶的天然選擇來達(dá)到提高目標(biāo)產(chǎn)物的目的[26]；3) 優(yōu)化表達(dá)，對(duì)表達(dá)基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，修飾SD序列和RBS位點(diǎn)[27]；4) 蛋白質(zhì)工程方面的改造[28-29]，包括有理設(shè)計(jì)[30]和無理設(shè)計(jì)[31]；5) 發(fā)酵工程方面改造，改變發(fā)酵條件和底物等，提高產(chǎn)物產(chǎn)量等。如進(jìn)一步優(yōu)化大腸桿菌異源生產(chǎn)丁醇途徑，則可考慮通過啟動(dòng)子優(yōu)化與酶的天然組合、支路途徑敲除、過表達(dá)、發(fā)酵條件優(yōu)化[12]等代謝工程手段結(jié)合進(jìn)一步提高丁醇產(chǎn)量。

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