鄧春圣 王春芳 朱光君 李鵬飛 李京力

（1中國人民解放軍第322醫(yī)院 大同037006；2山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心 太原030001）

脊髓損傷防治與再生修復(fù)是當(dāng)今神經(jīng)科學(xué)的重大難題和研究熱點(diǎn)，神經(jīng)干細(xì)胞（Neural stem cells，NSCs）的發(fā)現(xiàn)，為脊髓損傷開拓了新天地，為其治療和修復(fù)受損的脊髓運(yùn)動神經(jīng)元（motor neurons，MNs），提供了新的治療途徑［1，2］。本課題組與其他實(shí)驗(yàn)室均通過模擬體內(nèi)MNs的分化途徑將干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為表達(dá) MNs標(biāo)記物的神經(jīng)元［3，4］。這些研究僅是對干細(xì)胞誘導(dǎo)分化前后基因的表達(dá)變化進(jìn)行了研究，而沒有對誘導(dǎo)所得細(xì)胞與目的細(xì)胞間的差異進(jìn)行分析。

目前對miRNA的研究已成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)，有報道顯示，miR-126可以通過綁定到同源框來調(diào)控Hoxa9［5］，而Hox在脊髓運(yùn)動神經(jīng)元的發(fā)育過程中起著重要的作用［6］。miR-31是一種胚胎干細(xì)胞特異性的 miRNA［7］，同時我室研究人員也發(fā)現(xiàn)［8］，與運(yùn)動神經(jīng)元相比，miR-31在神經(jīng)干細(xì)胞中高表達(dá)。就此，我們對NSCs誘導(dǎo)分化所得膽堿能神經(jīng)元（運(yùn)動神經(jīng)元是膽堿能神經(jīng)元的一種）和運(yùn)動神經(jīng)元中miR-126和miR-31的表達(dá)進(jìn)行比較分析，以此了解兩種細(xì)胞間的差別。

材料和方法

選取健康孕齡17d的Wistar大鼠（由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供），按本室前期的純化方法，我們用免疫磁珠法分離獲得運(yùn)動神經(jīng)元，并從剩余的細(xì)胞中培養(yǎng)獲得神經(jīng)干細(xì)胞［8，9］。并按照本室前期的誘導(dǎo)分化方法將神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為膽堿能神經(jīng)元。分別收集誘導(dǎo)后所獲得的膽堿能神經(jīng)元和MNs。采用 mirVana miRNA Isolation Kit提取總RNA。

miR-126和miR-31表達(dá)的檢測應(yīng)用ABI公司的 TaqMan MicroRNA Assays real-time PCR 技術(shù)，該方法采用兩步法：

第一步，采用 TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為15μl中含：10ng總 RNA；3μl RT primer引物；7μl Master Mix（包含 dNTP mix；Multiscribe RT enzyme；10×RT buffer；RNase Inhibitor）。反應(yīng)條件為：16℃30min，42℃1h，85℃5min。將所得cDNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

第二步，采用ABI公司設(shè)計(jì)的實(shí)時定量PCR引物，miR-126 （P／N：4373331；Applied Biosystems）和 miR-31 （P／N：4395339；Applied Biosys-tems）。PCR擴(kuò)增體系為20μl中含：10μl 2×Taq－Man Gene Expression Master Mix；Real-time primer 1μl；cDNA 產(chǎn)物。在 ABI 7300型定量 PCR 儀上以下列條件進(jìn)行擴(kuò)增：95℃10min，95℃15s，60℃1min，循環(huán)40次。反應(yīng)設(shè)置4個復(fù)孔，以4.5S RNA（P／N：4386736；Applied Biosystems）作為內(nèi)對照。采用比較CT值法，應(yīng)用RQ Study軟件（Applied Biosystems）進(jìn)行miRNAs的相對定量分析。

之后，我 們 采 用 PicTar（http：／／pictar.mdcberlin.de／）對 miR-126和 miR-31的靶基因進(jìn)行預(yù)測分析，并通過Gene Ontology數(shù)據(jù)庫檢索，分別分析這些靶基因所參與的生物學(xué)途徑。

結(jié) 果

1.m iR-126和miR-31在NSCs分化所得膽堿能神經(jīng)元與MNs之間表達(dá)情況的比較

通過比較MNs和SCSCs誘導(dǎo)分化所得膽堿能神經(jīng)元中miR-126和miR-31的表達(dá)情況，我們發(fā)現(xiàn)miR-126在膽堿能神經(jīng)元中的表達(dá)是在MNs中的0.002倍（P＜0.05），miR-31在膽堿能神經(jīng)元中的表達(dá)是在 MNs中的56.444倍（P＜0.05）（圖1）。

圖1 A miR-126在SCSCs誘導(dǎo)分化所得膽堿能神經(jīng)元和MNs中的表達(dá)情況。圖1B miR-31在SCSCs誘導(dǎo)分化所得膽堿能神經(jīng)元和MNs中的表達(dá)情況。Fig.1AThe expression of miR-126in motor neurons and cholinergic neurons derived from SCSCs.Fig.1BThe expression of miR-31in motor neurons and cholinergic neurons derived from SCSCs.

2.m iR-126與miR-31預(yù)測靶基因及其參與的生物學(xué)過程

經(jīng)pictar檢索獲得miR-126預(yù)測靶基因16個，miR-31預(yù)測靶基因181個，通過Gene Ontology數(shù)據(jù)庫檢索分析，發(fā)現(xiàn)在約25%的miR-126預(yù)測靶基因參與信號傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)（表1），16.57%的 miR-31預(yù)測靶基因參與發(fā)育過程（表2）。

表1 miR-126預(yù)測靶基因及其參與的生物學(xué)過程Table 1 The Predicted target genes of miR-126and their participated biological process

表2 miR-31預(yù)測靶基因及其參與的生物學(xué)過程Table 2 The Predicted target genes of miR-31and their participated biological process

討 論

脊髓損傷是一種以損傷平面以下感覺、運(yùn)動功能完全喪失和尿便失禁為主要臨床表現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的嚴(yán)重創(chuàng)傷性疾病，通常是由于交通、勞動和運(yùn)動意外事故中常見的創(chuàng)傷類型，也是造成截癱的主要原因和人類致殘率最高的疾患之一。NSCs的發(fā)現(xiàn)為脊髓損傷的移植治療提供了新的希望。音猬因子（Shh）和維甲酸（RA）是運(yùn)動神經(jīng)元在體內(nèi)發(fā)育的關(guān)鍵因子［10，11］，Wichterle等通過模擬體內(nèi) MNs分化的途徑，在體外用Shh和RA誘導(dǎo)鼠胚胎干細(xì)胞先向脊髓祖細(xì)胞分化，進(jìn)而誘導(dǎo)脊髓祖細(xì)胞向運(yùn)動神經(jīng)元分化，最終20%-30%的細(xì)胞表達(dá)運(yùn)動神經(jīng)元的標(biāo)記物Hb9［3］。此后幾年中，也有實(shí)驗(yàn)室得出類似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果［12，13］。近年來，本課題組聯(lián)合應(yīng)用Shh和RA，誘導(dǎo)脊髓源性NSCs，所得的細(xì)胞可表達(dá)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（ChAT）［4］（ChAT 是運(yùn)動神經(jīng)元的重要標(biāo)記之一）。

近年來，對細(xì)胞分化過程miRNA作用的研究成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。有報道顯示，miR-126可以通過綁定到同源框來調(diào)控Hoxa9［14］，而Hox在脊髓運(yùn)動神經(jīng)元的發(fā)育過程中起著重要的作用［15］，Hox與Shh（運(yùn)動神經(jīng)元在體內(nèi)發(fā)育的關(guān)鍵因子）之間又存在著相互調(diào)控的關(guān)系［16］，由此推斷，miR-126在運(yùn)動神經(jīng)元的發(fā)育過程中可能有著重要的調(diào)控作用。miR-31是一種胚胎干細(xì)胞特異性的miRNA［17］，同時本課題組也觀察到miR-31在神經(jīng)干細(xì)胞較運(yùn)動神經(jīng)元表達(dá)高的現(xiàn)象［10］，這顯示miR-31可能在維持干細(xì)胞特性方面會起一定的作用。就此，我們在本實(shí)驗(yàn)中對miR-126和miR-31在運(yùn)動神經(jīng)元與神經(jīng)干細(xì)胞分化所得膽堿能神經(jīng)元間表達(dá)情況進(jìn)行了比較分析。我們發(fā)現(xiàn)，miR-126在MNs中的表達(dá)較NSCs分化所得膽堿能神經(jīng)元高，而miR-31的表達(dá)情況與miR-126相反。由此說明了誘導(dǎo)所得細(xì)胞與目的細(xì)胞之間在miRNA水平存在著差別，暗示著兩種細(xì)胞在基因表達(dá)調(diào)控水平的差異。就此，我們對miR-126和miR－31的靶基因進(jìn)行預(yù)測分析，并通過Gene Ontology數(shù)據(jù)庫檢索，分別分析這些靶基因所參與的生物學(xué)途徑，結(jié)果顯示，約25%的miR-126預(yù)測靶基因參與信號傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)，16.57%的miR-31預(yù)測靶基因參與發(fā)育過程，暗示兩種細(xì)胞可能在信號傳導(dǎo)和發(fā)育上存在有差別。同時，也提示miR-126和miR-31可以成為NSCs向MNs誘導(dǎo)分化過程中新的潛在作用靶標(biāo)，通過在分化過程中對它們的表達(dá)進(jìn)行干擾可以使誘導(dǎo)所得細(xì)胞與運(yùn)動神經(jīng)元之間差異逐步縮小，最終使神經(jīng)干細(xì)胞更加有效地應(yīng)用于脊髓損傷的治療。

［1］Louro J，Pearse DD.Stem and progenitor cell therapies：recent progress for spinal cord injury repair.Neurol Res，2008，30（1）：5-16

［2］Wrathall JR，Lytle JM.Stem cells in spinal cord injury.Dis Markers，2008，24（4-5）：239-250

［3］Wichterle H，Lieberam I，Porter JA，et al.Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons.Cell，2002，110（3）：385-397

［4］李鵬飛，王春芳.胚胎大鼠脊髓神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)與定向分化為膽堿能神經(jīng)元的研究.神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2007，23（6）：621-625

［5］Shen WF，Hu YL，Uttarwar L，et al.MicroRNA-126 Regulates HOXA9by Binding to the Homeobox.Molecular and cellular biology，2008，28（14）：4609-4019

［6］Dasen JS，Jessell TM.Hox networks and the origins of motor neuron diversity.Curr Top Dev Biol，2009，88：169-200

［7］Houbaviy HB，Murray MF，Sharp PA.Embryonic Stem Cell-Specific MicroRNAs.Development cell，2003，5（2）：351-358

［8］Hongen Wei，Chunfang Wang，Chuansen Zhang，et al.Comparative profiling of microRNA expression between neural stem cells and motor neurons in embryonic spinal cord in rat.International Journal of Developmental Neuroscience，2010，28（6）：545-551

［9］王菲，王春芳，李鵬飛，等.免疫磁珠法分離純化胚胎大鼠脊髓源運(yùn)動神經(jīng)元的方法探討.中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2009，18（4）：422-425

［10］Ranabe Y，Jessell TM.Diversity and pattern in the developing spinal cord.Science，1996，274（5290）：1115-1123

［11］Malaspina A，Turkheimer F.A review of the functional role and of the expression profile of retinoid signaling and of nuclear receptors in human spinal cord.Brain Res Bull，2007，71（5）：437-446

［12］Singh Roy N，Nakano T，Xuing L，et al.Enhancerspecified GFP-based FACS purification of human spinal motor neurons from embryonic stem cells.Exp Neurol，2005，196（2）：224-234

［13］Li XJ，Du ZW，Zarnowska ED，et al.Specification of motoneurons from human embryonic stem cells.Nat Biotechnol，2005，23（2）：215-221

［14］Shen WF，Hu YL，Uttarwar L，et al.MicroRNA-126 Regulates HOXA9by Binding to the Homeobox.Molecular and cellular biology，2008，28（14）：4609-4019

［15］Dasen JS，Jessell TM.Hox networks and the origins of motor neuron diversity.Curr Top Dev Biol，2009，88：169-200

［16］Tarchini B，Duboule D，Kmita M.Regulatory constraints in the evolution of the tetrapod limb anteriorposterior polarity.Nature，2006，443（7114）：985-988

［17］Houbaviy HB，Murray MF，Sharp PA.Embryonic Stem Cell-Specific MicroRNAs.Development cell，2003，5（2）：351-358