陳娜,馮鵬飛,張?jiān)Ｆ?/p>

（河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng),453003）

近年來(lái),整體柱已受到分析工作者的廣泛認(rèn)可,在生物大分子、蛋白質(zhì)及農(nóng)藥分析等領(lǐng)域顯示出其獨(dú)特的優(yōu)異性能[1-3].整體柱通常采用均相體系,包含功能單體、交聯(lián)劑、致孔劑等物質(zhì)配成混合溶液,在一定的實(shí)驗(yàn)條件下,經(jīng)水浴聚合、光聚合或微波聚合等手段制備而成.這樣制備的整體柱孔徑較密實(shí),孔隙率較小,滲透性較差.最近出現(xiàn)了一種新型的高內(nèi)相乳液法（high internal phase emulsion polymers,HIPE）制備整體柱.采用這種新的方法所制備的整體柱孔隙率最高可達(dá)90%[4-8],通透性較好,且網(wǎng)絡(luò)骨架清晰,有利于大分子物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、核酸、藥物）的分離分析.迄今為止,未見(jiàn)國(guó)內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道.

高內(nèi)相乳液是指分散相體積分?jǐn)?shù)在74%以上的一類乳液,常分為油包水（W/O）和水包油（O/W）兩種類型.其中油包水型是以苯乙烯、二乙烯基苯、甲基丙烯酸甘油酯等油溶性單體為連續(xù)相,以水相為分散相混合得到的乳白色均勻混合乳液.然后以高內(nèi)相乳液為模板可制備多孔整體材料,簡(jiǎn)稱為PolyHIPE.所制得的多孔材料（PolyHIPE）中含有大小不同的孔徑結(jié)構(gòu),直徑在10～1000 μm之間的球形的孔通常被稱為大孔,而在大孔壁上的直徑在0.1～10 μm的孔稱為聯(lián)接孔.由于PolyHIPE整體材料的多孔結(jié)構(gòu),使得其在大分子分離分析領(lǐng)域具有較廣闊的應(yīng)有前景[9].

本文采用高內(nèi)相乳液法（HIPE）制備了苯乙烯-二乙烯基苯類毛細(xì)管液相色譜整體柱.利用自組裝的微流液相系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行了色譜評(píng)價(jià),系統(tǒng)考察了不同的流動(dòng)相比例及流速等因素對(duì)分離效果的影響,并用掃描電子顯微鏡對(duì)其形態(tài)進(jìn)行了表征.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,本法所制備的毛細(xì)管柱對(duì)硫脲、苯、甲苯及乙苯4種物質(zhì)均可達(dá)到基線分離,同樣條件下連續(xù)進(jìn)樣7次,4種物質(zhì)的保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.78%～1.22%之間.

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

Agilent 1100型HPLC儀；毛細(xì)管電泳紫外檢測(cè)器（北京彩陸科學(xué)儀器有限公司）；Quanta 200掃描電子顯微鏡（FEI,Hillsboro,Oregon,USA）；N2000色譜數(shù)據(jù)處理軟件（浙江智達(dá)信息工程公司,浙江大學(xué)）；調(diào)溫磁力攪拌器（河南愛(ài)博特科技發(fā)展有限公司）；分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；水浴鍋（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；熔融石英毛細(xì)管（100 μmI.D.,375 μmO.D.河北省永年銳灃色譜器件有限公司）.

3-（甲基丙烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷（NewJerse,USA）；氫氧化鈉、鹽酸、Span-80（洛陽(yáng)市化學(xué)試劑廠）；苯乙烯（北京百靈威科技有限公司）；二乙烯基苯（Tokyo,Japan）；過(guò)硫酸鉀（天津化學(xué)試劑有限公司）；無(wú)水氯化鈣（天津永大化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心）；硫脲、苯、甲苯、乙苯（北京化學(xué)試劑公司）；乙腈（天津化學(xué)試劑公司,色譜純）；甲醇（天津市德恩化學(xué)試劑有限公司,色譜純）；實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水；其余未注明試劑均為分析純.

1.2 苯乙烯-二乙烯基苯類（ST-DVB）毛細(xì)管液相色譜整體柱的制備

毛細(xì)管的預(yù)處理過(guò)程見(jiàn)文獻(xiàn)[10],整體柱的制備過(guò)程如下：

分別按表1所列配制有機(jī)相和水相,放置12 h.使用前有機(jī)相通氮?dú)?5 min脫氣,水相超聲15 min.有機(jī)相不斷攪拌300～400 r/min,將水相緩慢加入到有機(jī)相中,控制滴加速度每2～3 s 1滴,再攪拌30 min,形成均勻的乳化溶液；然后將乳化液部分填充28 cm（毛細(xì)管總長(zhǎng)為47 cm）到100 μm I.D.的毛細(xì)管內(nèi)（約耗時(shí)10 min）,進(jìn)行水浴聚合60℃反應(yīng)16 h.

表1 苯乙烯乳化液配方Tab.1 PolyHIPE ST-DVB-based Monolith

1.3 毛細(xì)管整體柱的微流液相色譜評(píng)價(jià)

本實(shí)驗(yàn)采用自組裝的微流液相色譜系統(tǒng)對(duì)所制備的PolyHIPE整體柱進(jìn)行了色譜評(píng)價(jià),基線分離了4種模型化合物（硫脲,苯,甲苯,乙苯）.具體的實(shí)驗(yàn)裝置可參考我們課題組之前發(fā)表的文獻(xiàn)[11-12].本實(shí)驗(yàn)中所采用的分流毛細(xì)管長(zhǎng)度為2 m,內(nèi)徑為100 μm.

2 結(jié)果與討論

2.1 整體柱結(jié)構(gòu)的表征

用掃描電子顯微鏡對(duì)制備的整體柱表觀結(jié)構(gòu)形態(tài)進(jìn)行了表征,如圖1所示.從圖1可以看出,用HIPE法制備的整體柱內(nèi)部高度網(wǎng)絡(luò)狀連接,具有較為開(kāi)放的孔結(jié)構(gòu).這可能跟高內(nèi)相乳液的非均相體系有關(guān).可以形成大小不一的孔穴結(jié)構(gòu),大的約有10 μm,小的約2～3 μm.

圖1 毛細(xì)管內(nèi)整體柱電鏡掃描Fig.1 SEMphotopgraphs of the monolithic column

2.2 影響PolyHIPE整體柱制備的因素

通常整體柱制備方法有：乳液模板、溶膠凝膠、水熱合成、紫外光聚合及微波聚合等方法.其中PolyHIPE乳液模板法又分為油包水乳液、水包油乳液及超臨界二氧化碳法.本文采用油包水乳液法：以苯乙烯-二乙烯基苯為單體,SPAN-80為乳化劑,含有K2S2O8和CaCl2的水溶液為分散相（其中K2S2O8為化學(xué)引發(fā)劑,CaCl2為電解質(zhì)）,通過(guò)水浴熱聚合60℃反應(yīng)16 h使其固化,然后用甲醇沖洗毛細(xì)管柱,將沒(méi)有反應(yīng)完的單體溶液及水相沖洗出來(lái)；這樣就制備好了所需的PolyHIPE整體柱.

如何制備穩(wěn)定性高、重現(xiàn)性好的PolyHIPE整體柱,這是研究的關(guān)鍵.其主要影響因素包括：乳化劑的種類及濃度、分散相的體積分?jǐn)?shù)、致孔劑的種類及單體的極性.乳化劑一般都采用各種表面活性劑,制備油包水型高內(nèi)相乳液要求它的親水親油平衡值（hydrophile-lipophile balance,HLB）在2～6之間,Span-80為最佳,其HLB值為4.3.Span-80的濃度對(duì)PolyHIPE整體柱的穩(wěn)定性很重要.濃度大約在7%～50%時(shí),可以形成開(kāi)孔的PolyHIPE整體材料.我們所制備的整體柱中Span-80濃度為有機(jī)相體積的20%,從SEM圖中（圖1）可以看出,能形成相互之間連通的泡孔.

在連續(xù)相（即油相）保持不變的情況下,分散相（即水相）的體積分?jǐn)?shù)越大,形成的泡孔孔徑越大,孔徑分布越寬.致孔劑主要影響PolyHIPE整體出來(lái)的孔徑結(jié)構(gòu),從而影響整體材料的比表面積.可以采用一種或多種致孔劑,我們實(shí)驗(yàn)沒(méi)有加入致孔劑；如果對(duì)比表面積要求比較高的如固相萃取、固相微萃取等領(lǐng)域,可考慮加入致孔劑.一般要求制備PolyHIPE整體柱的單體疏水性要較強(qiáng),像苯乙烯這種不溶于水的單體較為理想.

2.3 PolyHIPE整體柱的色譜評(píng)價(jià)

實(shí)驗(yàn)采用自組裝的微流液相色譜系統(tǒng)對(duì)所制備的PolyHIPE整體柱進(jìn)行了色譜評(píng)價(jià),基線分離了4種模型化合物（硫脲、苯、甲苯、乙苯）,系統(tǒng)考察了不同的流速及流動(dòng)相比例等因素對(duì)分離效果的影響.圖2為4種模型化合物的范式方程.從圖中可以看出,隨著流速?gòu)?.400 mL/min升高到0.700 mL/min,硫脲的理論塔板高度H基本在720 μm左右保持不變,而芳香烴類化合物苯、甲苯及乙苯的H隨流速增大在不斷增大.這可能是因?yàn)榱螂迨遣槐Ａ粑镔|(zhì),它的柱效基本保持不變,而芳香烴類化合物由于在色譜柱上進(jìn)行了保留,符合范式方程,隨流速變化而變化.圖3是不同流速下的代表性分離,隨流速?gòu)?.700 mL/min降低到0.400 mL/min時(shí),4種物質(zhì)的保留時(shí)間都在延后.

圖2 4種模型化合物范式方程Fig.2 Van Deemter plots for four model analytes

圖3 不同流速下代表性分離Fig.3 Chromatograms in different flowrates for the separation offour model analytes

圖4為流動(dòng)相比例對(duì)理論塔板高度H的影響關(guān)系.實(shí)驗(yàn)采用流動(dòng)相為乙腈和水的混合溶液,乙腈含量的變化范圍為30%～42.5%.隨著乙腈含量的增大,硫脲、苯及甲苯的H逐漸降低,柱效增大；而最后一個(gè)物質(zhì)乙苯的H反而在不斷增大,柱效減小.這可能是因?yàn)殡S著乙腈含量的降低,乙苯的色譜峰展寬越來(lái)越大,保留時(shí)間也在不斷增大,理論塔板數(shù)n就變大,H就變小了；而其他物質(zhì)沒(méi)有乙苯這么嚴(yán)重,所以就產(chǎn)生了這種現(xiàn)象.圖5為不同流動(dòng)相比例下的代表性分離.從圖5中可以看出,4種模型化合物在流動(dòng)相變化范圍內(nèi)（乙腈含量從42.5%減少到30%）均能達(dá)到基線分離,隨著流動(dòng)相中乙腈含量的減少,各峰之間分離度逐漸增大,各物質(zhì)保留時(shí)間逐漸延長(zhǎng),而硫脲的保留時(shí)間基本保持不變.這一現(xiàn)象也可說(shuō)明,硫脲在色譜柱上基本沒(méi)有保留,可用于測(cè)色譜柱的死時(shí)間.

圖4 乙腈含量與理論塔板高度H關(guān)系Fig.4 The relationship betweenthe ACNpercentage equal and the theoretical plate（H）for four model analytes

圖5 不同流動(dòng)相比例下代表性分離Fig.5 Chromatograms in different flowrates for the separation offour model analytes

2.4 PolyHIPE整體柱的孔隙率

對(duì)于毛細(xì)管整體柱而言,孔隙率（εT）是指整體柱內(nèi)孔隙所占體積與毛細(xì)管整體柱總體積之比,孔隙率是評(píng)價(jià)毛細(xì)管整體柱內(nèi)網(wǎng)絡(luò)骨架的一個(gè)重要參數(shù).可通過(guò)以下計(jì)算公式簡(jiǎn)單計(jì)算出孔隙率：

上式中v代表流速,t0為死時(shí)間（即硫脲的保留時(shí)間）,r為毛細(xì)管半徑,L為柱長(zhǎng).可以看出,流速和流動(dòng)相比例對(duì)孔隙率沒(méi)有影響.根據(jù)公式可以計(jì)算改變流速的14次實(shí)驗(yàn)得到平均εT為0.8386；而改變流動(dòng)相比例的12次實(shí)驗(yàn)得到平均εT為0.8112,兩個(gè)結(jié)果非常接近,說(shuō)明我們所制備的PolyHIPE整體柱的孔隙率達(dá)到了80%以上.表2、表3分別為流速及流動(dòng)相比例對(duì)孔隙率的影響.

表2 流速對(duì)孔隙率的影響Tab.2 The influence offlowrate to total porosity

表3 流動(dòng)相對(duì)孔隙率的影響Tab.3 The influence of mobile phase to total porosity

2.5 PolyHIPE整體柱的穩(wěn)定性

為了考察所制備的PolyHIPE整體柱的穩(wěn)定性,采用相同的實(shí)驗(yàn)條件（流速=0.500 mL/min,ACN∶H2O=35∶65（v/v））連續(xù)進(jìn)樣7次,整體柱的背壓基本穩(wěn)定在6.9～7.0 Mpa左右,說(shuō)明采用高內(nèi)相乳液法制備的PolyHIPE整體柱機(jī)械穩(wěn)定性較好,在經(jīng)過(guò)約42次進(jìn)樣后,仍可保持較好的穩(wěn)定性.圖6給出了連續(xù)進(jìn)樣7次,4種模型化合物的保留時(shí)間和3個(gè)峰對(duì)之間的分離度R的變化情況,4種物質(zhì)的保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.78%～1.22%之間.

圖6 連續(xù)進(jìn)樣7次保留時(shí)間（左）分離度（右）重現(xiàn)性Fig.6 Reproducibility of retention time（left）and resolution（right）over 7 runs

3 結(jié)論

本文采用高內(nèi)相乳液法（HIPE）制備了苯乙烯-二乙烯基苯類毛細(xì)管液相色譜整體柱.整體柱內(nèi)部孔徑分布具有獨(dú)特的大孔及通孔結(jié)構(gòu),使其滲透性較傳統(tǒng)的整體柱更強(qiáng),在分離大分子物質(zhì)時(shí)能得到更好的分離效果,在以后將有更為廣闊的應(yīng)用前景.

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