張惠 陳衛(wèi)昌

三氧化二砷對(duì)大腸癌LoVo細(xì)胞生長及Bcl-2、Bax表達(dá)的影響

張惠 陳衛(wèi)昌

目的 研究三氧化二砷(As2O3)對(duì)人大腸癌細(xì)胞株LoVo中的生長及三氧化二砷對(duì)Bcl-2、Bax表達(dá)的影響。方法 采用不同濃度的As2O3處理LoVo細(xì)胞，MTT法測定細(xì)胞的生長抑制效應(yīng);免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測人結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo中Bcl-2、Bax的表達(dá)。結(jié)果 MTT結(jié)果示As2O3對(duì)大腸癌LoVo細(xì)胞的生長有抑制作用，且有時(shí)間-劑量依賴性(P＜0.05或P＜0.01);免疫細(xì)胞化學(xué)法結(jié)果示As2O3可使LoVo細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)下降，Bax表達(dá)升高(P＜0.01)。結(jié)論 三氧化二砷對(duì)大腸癌細(xì)胞生長有抑制作用，且呈時(shí)間、劑量依賴性;其機(jī)制可能與改變Bcl-2和Bax的表達(dá)水平有關(guān)。

As2O3;大腸癌;Bcl-2;Bax

三氧化二砷(Arsenic Trioxide，As2O3)是我國傳統(tǒng)中藥砒霜的主要成分，現(xiàn)已成為國內(nèi)外研究熱點(diǎn)。研究表明，三氧化二砷對(duì)多種實(shí)體瘤的增殖有抑制作用，亦可抑制人大腸癌細(xì)胞的生長，其機(jī)制可能是抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡［1-3］，但As2O3對(duì)大腸癌Bcl-2及Bax表達(dá)的影響的相關(guān)研究較少。本實(shí)驗(yàn)用As2O3作用于人大腸癌LoVo細(xì)胞株，觀察腸癌細(xì)胞的生長及Bcl-2、Bax表達(dá)變化，旨在探討三氧化二砷的抗腫瘤機(jī)制及防治腸癌的可行性。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系 人大腸癌LoVo細(xì)胞系(中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所)，在含10%胎牛血清的RPMI-1640(Gibco公司產(chǎn)品)完全培養(yǎng)液、37℃、含5%CO2、95%空氣、95%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 藥物及試劑 三氧化二砷(1 g/L)(美國Sigma公司)，4℃冰箱保存，實(shí)驗(yàn)前用培養(yǎng)基稀釋As2O3(終濃度分別為1.5μmol/L;3.0μmol/L;6.0μmol/L)。四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)(美國Sigma公司)。Bcl-2、Bax免疫化學(xué)一抗、二抗(武漢博士德生物公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為:對(duì)照組(未給藥)，實(shí)驗(yàn)組1(As2O31.5μmol/L)，實(shí)驗(yàn)組2(As2O33.0μmol/L)，實(shí)驗(yàn)組3(As2O36.0μmol/L)

1.4 四氮唑藍(lán)(MTT)比色還原法檢測 按試劑盒說明書對(duì)各組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用酶標(biāo)儀檢測490nm波長處的每孔吸光度值(Absorbance，A 值)，計(jì)算細(xì)胞生存率(Survival Rate，SR)，以對(duì)照組的細(xì)胞生存率作為100%。細(xì)胞生存率(SR)=實(shí)驗(yàn)孔A值/對(duì)照孔A值×100%。

1.5 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測 收集不同濃度處理48 h后的各組腸癌細(xì)胞，按SP法操作。Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)結(jié)果判定:細(xì)胞胞漿或胞膜染為棕黃色為陽性。在高倍鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞，以陽性細(xì)胞占總數(shù)的百分比作為陽性細(xì)胞百分率。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件分析所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，組間比較用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 As2O3對(duì)大腸癌LoVo細(xì)胞生長的影響 MTT結(jié)果表明As2O3在1.5μmol/L濃度干預(yù)24 h后開始表現(xiàn)抑制作用，但作用尚不顯著，隨著濃度增加和作用時(shí)間延長，As2O3對(duì)腸癌細(xì)胞的抑制作用漸增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01或P＜0.05)。見表1。

表1 As2 O3對(duì)腸癌細(xì)胞生存率的影響(%)

2.2 三氧化二砷對(duì)大腸癌細(xì)胞株中Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)影響 大腸癌細(xì)胞對(duì)照組中的Bcl-2蛋白表達(dá)明顯，陽性率為(87.50±5.10)%，經(jīng) As2O3作用后，實(shí)驗(yàn)組1(As2O31.5 μmol/L)Bcl-2蛋白陽性表達(dá)受到抑制，陽性率為(76.52±4.92)%，實(shí)驗(yàn)組2(As2O33.0μmol/L)Bcl-2蛋白表達(dá)減弱，陽性率為(55.95±2.24)%，實(shí)驗(yàn)組3(As2O36.0μmol/L)Bcl-2蛋白表達(dá)明顯下降，陽性率為(35.95±3.24)%，有劑量依賴性，各組細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)差異顯著，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。Bax蛋白在對(duì)照組微弱表達(dá)，陽性率為(15.42±3.12)%，經(jīng)As2O3作用后，隨著濃度增加，各組表達(dá)增強(qiáng)，陽性率分別(26.73±3.72)%，(45.83±3.26)%，(73.68±2.15)%，有劑量依賴性，各組細(xì)胞Bax蛋白的表達(dá)差異顯著，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

3 討論

三氧化二砷是從砒霜中提煉出來的有效藥用成分，其用于治療白血病已取得較好的療效，現(xiàn)將其應(yīng)用于肝癌、肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等多種實(shí)體瘤的實(shí)驗(yàn)和臨床研究［1-3］亦漸增多，研究結(jié)果顯示了良好的前景。研究表明，三氧化二砷主要是通過誘導(dǎo)細(xì)胞分化和凋亡抑制細(xì)胞生長而起抗腫瘤作用。劉琳等［4］通過臺(tái)盼蘭染色法和MTT法等觀察體外活細(xì)胞生長，結(jié)果揭示As2O3可以明顯抑制體外人大腸癌CoLo-320細(xì)胞的生長，并呈時(shí)效和量效特點(diǎn);電子超微結(jié)構(gòu)觀察顯示，As2O3可誘導(dǎo)人大腸癌細(xì)胞出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變。

Bcl-2基因家族是目前最具代表性的調(diào)控細(xì)胞凋亡的基因家族，其家族主要成員包括兩大類:一類是抑制細(xì)胞凋亡的基因，如bcl-2、bcl-xl、mcl-1等，bcl-2是其中最重要的基因，其表達(dá)上調(diào)，凋亡受抑制;另一類是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因，如bax、bad、bcl-xs等，Bax是一種與bcl-2相關(guān)的蛋白，與bcl-2有40%的同源性，其表達(dá)上調(diào)，能加速細(xì)胞凋亡［5］。研究表明，bcl-2與bax比例決定細(xì)胞凋亡程度［6］。

大腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程比較復(fù)雜，其機(jī)制至今仍不甚清楚。本實(shí)驗(yàn)研究顯示As2O3可下調(diào)大腸癌LoVo細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)，上調(diào)Bax蛋白表達(dá)，且呈時(shí)間-劑量依賴性，這為深入了解Bcl-2、Bax蛋白在大腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用以及研究開發(fā)Bcl-2、Bax蛋白的分子靶向治療藥物提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，值得臨床進(jìn)一步研究應(yīng)用。

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Effects of grow th and Bcl-2 and Bax expression by arsenic trioxide in hum an colorectal cancer LoVo c e l l s

ZHANGHui，CHENWei-chang.Department of Onclogy，Suzhou Municipal Hospital(North Area)，Suzhou2 1 5 0 0 8，，China

Objective To investigate the effects of arsenic trioxide on the cell growth and the expression of Bcl-2 and Bax in human colorectal cancer cells.M ethods In vitro，human colorectal cancer cells was treated by As2O3in various concentrations，and then MTTmethod was used to assay the effect of cell growth inhibition;the immunocytochemistry(ICC)analyzed the expression of Bcl-2 and Bax.Results As2O3inhibited the growth of the human colorectal carcinoma cells，and the inhibition effectwas time-dose dependent(P ＜0.05 or P ＜0.01).Bcl-2 expression was downregulated，and Bax expression was upregulated(P ＜0.01).Conclusion Arsenic trioxide had inhibition effect on the growth of human colorectal cancer cells in a time-dose dependentmanner，which may change the Bcl-2 and Bax expression and the level.

Arsenic trioxide;colorectal cancer;Bcl-2;Bax

215008 蘇州市立醫(yī)院北區(qū)腫瘤科(張惠);蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科(陳衛(wèi)昌)