董 魁，賈 挺，劉 麗，姜其聲，金孟民，林海濤，吳曉玲，莊云龍

(山東省血液中心，濟南250014)

人類白細胞抗原(HLA)位于6號染色體短臂區(qū)域，是由一組緊密連鎖的基因座所組成的具有高度多態(tài)性的遺傳復合體。HLA 是機體內(nèi)特異性免疫識別和免疫應答的主要成分，是影響造血干細胞移植成功的關(guān)鍵因素之一，具有顯著的人種、民族和地域差異。截至2011年4月，HLA-A位點的等位基因數(shù)目已達1 601個，其中HLA-A*02家族包含了405個等位基因。HLA-A*02等位基因在不同地區(qū)和種族中的分布存在較大差異，且該基因家族某些等位基因錯配會導致接受造血干細胞移植的患者發(fā)生重度急性移植物抗宿主病(aGVHD)，而該基因家族的另一些錯配對移植結(jié)果無不良影響［1，2］。HLA-A*02是山東骨髓庫中最主要的HLA-A等位基因之一，其等位基因水平多態(tài)性尚無資料積累。本研究旨在調(diào)查分析山東骨髓庫漢族人群HLA-A *02位點各等位基因的分布情況，初步評估山東漢族人群HLA-A*02位點匹配情況及移植風險，為HLA-A*02患者在山東骨髓庫尋找合適的供者提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 隨機選取750例山東漢族骨髓志愿捐獻者(男401例、女349例，年齡23～45歲，平均36歲)的EDTA抗凝全血。

1.2 HLA-A*02等位基因檢測 采用 EZ Bead system-32 DNA提取工作站提取DNA并測定OD260和OD280值，調(diào)整DNA濃度。以提取的DNA為模板，Taq酶(0.037 5 U)和包含引物(1 μM)等的混合物共10 μL;PCR反應體系擴增HLA-A基因的外顯子和內(nèi)含子序列。PCR擴增反應參數(shù)為96℃、2 min，1個循環(huán);96℃、30 s，65℃、30 s，5個循環(huán);72℃、120 s，96℃、30，62℃、30 s，35個循環(huán);72℃、120 s，10℃、4 h。反應結(jié)束后取2.5 μL于1.5%的瓊脂糖凝膠上檢驗擴增產(chǎn)物。在對應陽性孔內(nèi)的EP管中加入FastAP(1 U/μL)0.8 μL和Exonuclease I(20 U/μL)0.2 μL，混勻后于PCR儀中37℃、15 min，85℃、15 min。依照電泳圖稀釋PCR產(chǎn)物后將各位點PCR產(chǎn)物1 μL分別轉(zhuǎn)移到標記好的擴增板對應位置，取380 μL(配100個PCR混合物)各種Sequencing Primer Mix，分別置于16個1.5 mL潔凈的離心管內(nèi)，再分別加入20 μL BigDye，混勻后，取各混合物4 μL加入到對應擴增板孔，共5 μL PCR反應體系，雙向單鏈擴增HLA-A基因的2/3/4外顯子。Sequencing PCR反應參數(shù)為96℃、1 min，1個循環(huán);96℃、100 s，60℃、120 s，40個循環(huán);10℃、4 h。擴增結(jié)束后，向每孔中加入125 mM EDTA 2.5 μL，混勻后，加入無水乙醇15 μL，再充分混勻，室溫避光10 min。2 250 g離心30 min。將板倒置于吸水紙上，180 g再離心1 min。70%乙醇洗滌干燥后，每孔加入甲酰胺10 μL。置于3730測序儀上檢測。測序后導出的結(jié)果由ATF1.0.2.41(Conexio Genomics)軟件分析，依據(jù)的HLA數(shù)據(jù)庫版本為08/ 13/10。觀察HLA-A*02的基因頻率、等位基因構(gòu)成比、血清學組特異性頻率分布，對HLA-A*02陽性標本行高分辨分型，直接計數(shù)法得到HLA-A*02各等位基因的觀察數(shù)，并計算各等位基因頻率。結(jié)果與不同國家和地區(qū)人群HLA-A*02各等位基因分布情況比較。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0軟件行統(tǒng)計學處理。不同人群間HLA-A*02等位基因頻率分布比較采用χ2檢驗，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HLA-A*02的基因檢測情況 750份標本共363份HLA-A*02陽性，HLA-A*02的基因頻率為0.288。共檢出6種HLA-A*02等位基因，分屬3種血清學特異性，各等位基因頻率、等位基因構(gòu)成比及相應血清學特異性基因頻率見表1。

表1 750份標本HLA-A*02基因頻率、等位基因構(gòu)成比和血清學組特異性頻率分布

2.2 363份HLA-A*02陽性標本HLA-A*02高分辨分型 見表2。其中以A*0201 A*1101分型最常見，血清學組特異性以A2、A11觀察數(shù)目最多。

表2 750份樣品中HLA-A*02等位基因主要組合和血清學組特異性組合分布

2.3 不同國家和地區(qū)人群HLA-A*02各等位基因分布 山東漢族骨髓供者與其他人群HLA-A*02等位基因分布及其頻率比較見表3。山東漢族以A *0201(A2)為優(yōu)勢基因，日本和韓國人群同山東漢族一致，但與韓國人群中A*0201的分布相比差異顯著。香港、四川和臺灣人群中則以A*0207(A2)為優(yōu)勢基因，與山東漢族中的該基因分布相比有顯著性差異。

表3 不同國家和地區(qū)人群HLA-A*02各等位基因分布

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，A*0201是北方漢族人群的優(yōu)勢基因［8］，而 A*0207是南方漢族人群的優(yōu)勢基因［3～5］，本研究結(jié)果顯示，HLA-A*0201基因頻率最高(0.137)，A*0210基因頻率最低;以A*0201在HLA-A*02中的構(gòu)成比最高(47.56%)，即山東骨髓庫中A*0201是最主要的HLA-A*02等位基因，此符合北方漢族的特征。除優(yōu)勢基因不同外，山東漢族A*0206基因構(gòu)成比高于香港、四川和臺灣人群，而A*0207基因構(gòu)成比卻低于香港、四川和臺灣人群。山東漢族A*0203的構(gòu)成比低于香港、四川和臺灣人群，這也符合A*0203是南方漢族人群中的一個常見基因的特征。以上結(jié)果表明山東漢族HLA-A*02等位基因的總體分布格局與香港、四川和臺灣人群存在明顯差異。值得注意的是，中國人群A*0203基因的構(gòu)成比均明顯高于日本和韓國人群，表明日本和韓國人群中HLA-A*02等位基因分布與中國人群之間存在較大差異。A*0205屬于另外一個HLA-A*02亞群，與其余5個等位基因相比，在基因序列和進化關(guān)系上存在較大差異，這一亞群在亞裔人群中很罕見［9］。

研究HLA-A*02位點的匹配情況對探討移植的風險具有深遠的臨床意義。Kawase等［1］發(fā)現(xiàn)，HLA-A*0201者接受A*0206的移植物以及A* 0207者接受 A*0206的移植物，其病死率和aGVHD的發(fā)病率均會顯著增加。Morishima等［2］也發(fā)現(xiàn)了類似的移植案例，同HLA-A等位基因匹配的移植相比，A*0201/A*0206錯配的移植受者病死率顯著增高，且aGVHD發(fā)病率有增加的趨勢。這些報道表明，含有A*0206的錯配會增大造血干細胞移植失敗的風險，A*0206不適合作為A*0201和A*0207的供者。山東漢族人群A*0206的基因頻率相對較高，A*0206和A*0201等位基因相對頻率之和超過70% ，與香港、四川及臺灣人群相比，山東骨髓庫漢族捐獻者由A*0201與A*0206錯配引起的移植風險較高。值得注意的是，上述報道中其他A*02的等位基因錯配的供患者人數(shù)均較少，此可能會掩蓋一些涉及其他等位基因的禁忌錯配，還有待于進一步研究。我們認為，在衡量HLA等位基因群體分布對造血干細胞移植的影響時，除多態(tài)性水平比較外，分析主要的錯配類型對移植效果的影響亦是非常必要的。

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