楊霄鵬 李秋芳 楊瑞玲 (鄭州大學第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內科,河南 鄭州 45004)
丁苯酞預處理對抗大鼠腦缺血再灌注損傷后腦水腫的作用機制
楊霄鵬 李秋芳1楊瑞玲2(鄭州大學第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內科,河南 鄭州 450014)
目的探討丁苯酞對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用。方法96只健康雄性Wistar大鼠隨機分為假手術組、缺血再灌注組、丁苯酞(NBP)干預組,各組按再灌注6、24、48、72 h四個時間點分為4個亞組,每組8只。采用線栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型,HE染色觀察腦組織形態(tài)病理學變化,免疫組化法測定大鼠腦缺血再灌注不同時間水通道蛋白-4(AQP-4)的表達,干濕重法測定同側腦組織的含水量。結果 與假手術組比較,缺血再灌注組AQP-4及含水量在缺血再灌注6 h明顯升高,于48 h達到峰值(P<0.05);NBP預處理組AQP-4陽性表達與含水量在各時間點明顯增加但低于缺血再灌注組(P<0.05)。結論NBP預處理可降低腦缺血再灌注損傷大鼠AQP-4的表達,有效防治腦缺血再灌注損傷后腦水腫的形成。
丁基苯酞;缺血再灌注;腦水腫
水通道蛋白(AQPs)是影響水跨膜轉運的一種膜蛋白,AQP-4是其家族中的一員,廣泛分布于腦膠質細胞、室管膜細胞以及毛細血管周圍的星形膠質細胞足突上〔1〕。AQP-4在缺血性腦水腫的產生和發(fā)展過程中起重要作用〔2〕。丁苯酞(NBP)對缺血性腦卒中具有肯定的治療作用,但其抗缺血的具體機制目前尚未明確。本文旨在探討NBP是否通過調節(jié)缺血再灌注大鼠腦組織AQP-4的表達,進而減輕腦水腫,從而為NBP臨床治療腦缺血再灌注損傷提供理論基礎。
1.1 實驗動物及分組 健康雄性Wistar大鼠96只,體質量240~280 g,由鄭州大學動物中心提供。隨機分為假手術組,缺血再灌注組,NBP治療組。每組按再灌注后6、24、48、72 h四個時間點分為4個亞組,每組8只。
1.2 藥物和主要試劑 NBP由石藥集團恩必普藥業(yè)有限公司提供,批號09110611。以0.5%Tween80制成10 mg/m l混懸液用于整體動物腹腔注射。AQP-4試劑盒(武漢博士德生物有限公司),鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接(SP)法免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)。
1.3 方法
1.3.1 給藥方法 假手術組不給藥。治療組于再灌注同時腹腔注射NBP 80 mg/kg,模型組再灌注同時予等劑量生理鹽水。
1.3.2 實驗動物模型建立 改良線栓法制作大鼠左側大腦中動脈阻塞腦缺血模型。10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉,仰臥固定,常規(guī)消毒,取頸部正中切口,分離并暴露左側頸總及頸內、外動脈。分離迷走神經(jīng),結扎左側頸總及頸外動脈根部,由左側頸總動脈分叉處剪一小口插入頭端燒圓、涂蠟、呈鈍形的直徑為0.245 mm的尼龍魚線,線栓插入深度約18~20 mm,感有輕微阻力時停止,扎緊并固定栓線,縫合皮膚,阻斷血流2 h后,抽提栓線至頸總動脈內實現(xiàn)再灌注。假手術組除不插入尼龍魚線外,其余步驟同手術組。選擇蘇醒后右上肢屈曲、行走時向右側旋轉或右側肢體癱瘓的大鼠造模成功者進行后續(xù)實驗。
1.3.3 SP法測定AQP-4 各個不同時間點10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,0.9%生理鹽水250 ml心內灌注沖洗,后用4%多聚甲醛溶液固定,取視交叉前后2 mm的大腦組織,多聚甲醛溶液固定72 h,常規(guī)脫水,石蠟包埋,冠狀切片,切片水化后,過氧化物酶阻斷,熱抗原修復,滴加一抗過夜,滴加二抗,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,蘇木素伊紅(HE)染色,二甲苯透明,中性樹膠封片。采用Biosens Digital Imaging System(上海山富科學儀器有限公司)圖像分析系統(tǒng)進行定量分析,每只大鼠共染色5張切片,在光學顯微鏡下,隨機對免疫組化的每張切片選取5個區(qū)域進行觀察。
1.3.4 腦組織含水量的測定 采用干濕重法測定腦組織含水量,動物迅速斷頭取腦,取進針點后腦組織約100 mg,電子天平先稱取濕重,放入電熱恒溫培養(yǎng)干燥兩用箱100℃烘烤48 h,再稱取干重。腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。
1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析,計量資料均以±s表示,多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析,任意兩組之間的比較采用LSD檢驗。
2.1 腦組織形態(tài)學的改變 假手術組缺血側腦組織HE染色細胞形態(tài)無異常。缺血再灌注組:再灌注6 h神經(jīng)細胞胞體腫脹;再灌注24~48 h腦組織梗死灶結構疏松,可見間質水腫,周圍出現(xiàn)部分細胞核固縮濃染,核碎裂、核溶解;再灌注72 h后細胞腫脹減輕,有少量膠質細胞增生。NBP預處理組病理改變輕微,較少神經(jīng)元變性壞死。見圖1。
2.2 AQP-4的動態(tài)變化 再灌注6 h后神經(jīng)細胞AQP-4陽性表達增加不明顯,24 h AQP-4陽性表達明顯增加,48 h達到高峰,72 h后仍強于正常。AQP-4的陽性表達位于細胞膜、血管周圍,陽性表達呈棕黃色。假手術組神經(jīng)細胞AQP-4呈弱陽性表達。見表1。
表1 各組大鼠再灌注不同時點腦組織AQP-4平均灰度值(±s,n=8)
表1 各組大鼠再灌注不同時點腦組織AQP-4平均灰度值(±s,n=8)
與假手術組比較:1)P<0.05;與前一時間比較:2)P<0.05;與缺血再灌注組比較:3)P<0.05;下表同
組別6 h 24 h 48 h 72 h假手術組 16.28±4.88 16.67±4.92 16.89±4.82 15.99±4.74缺血再灌注組 42.96±5.211) 53.88±4.651)2) 65.69±4.061)2) 59.06±5.231)2)NBP處理組 31.76±6.341)3) 41.97±5.331)2) 52.84±4.821)2)46.78±5.261)2)
2.3 腦組織含水量的變化 再灌注后6 h開始出現(xiàn)腦水腫,48 h腦組織含水量達到高峰,72 h后逐漸消退。見表2。
表2 各組大鼠再灌注不同時點腦組織含水量的變化(±s,n=8)
表2 各組大鼠再灌注不同時點腦組織含水量的變化(±s,n=8)
組別6 h 24 h 48 h 72 h假手術組 76.35±0.32 76.41±0.34 76.39±0.40 76.21±0.29缺血再灌注組 78.72±0.571) 81.44±1.031)2) 82.98±1.261)2) 80.13±0.741)2)NBP處理組 77.56±0.491)2)79.03±0.941)2)3)80.11±0.971)2)3)78.26±0.521)2)3)
圖1 HE染色觀察各組大鼠腦組織形態(tài)學改變
缺血性腦血管病后腦水腫可引起顱高壓,加重病情,甚至導致患者死亡,但其發(fā)生的機制尚不十分清楚。近年來研究表明,水分子的轉運需要通過AQPs來調節(jié),其在腦水腫形成中的作用成為臨床尋找治療腦水腫的新熱點。目前發(fā)現(xiàn)AQPs家族共有13種,AQP-4在腦組織中分布最廣,主要分布在星形膠質細胞膜表面,特別是血管周圍的膠質細胞突起上,對腦內水代謝平衡起重要調節(jié)作用,與腦水腫發(fā)生發(fā)展密切相關〔3〕。
NBP為人工合成的消旋體,現(xiàn)代藥理學研究表明,NBP能夠保護線粒體、改善細胞能量代謝、增加腦缺血區(qū)的血流量〔4〕,可明顯縮小局部腦缺血的梗死面積,對缺血性腦梗死具有肯定的治療作用〔5〕。NBP預處理在防治腦缺血再灌注損傷后腦水腫的作用研究報道較少。本實驗中觀察到缺血再灌注后6 h腦組織含水量增加,隨著再灌注時間延長,腦組織含水量進一步增多,48 h達高峰,72 h后開始降低。與文獻報道結果基本一致〔6〕。缺血再灌注后的不同時間點,缺血區(qū)AQP-4表達程度也不同。再灌注6 h后AQP-4表達增強,24~48 h表達呈強陽性,72 h開始下降,與水腫程度及神經(jīng)細胞損傷程度一致。NBP預處理組各時間點神經(jīng)細胞損傷程度、水含量及AQP-4的表達強度均較缺血再灌注組降低但仍高于假手術組。說明NBP預處理后可能通過某種途徑抑制AQP-4的表達,從而防治腦缺血再灌注損傷后腦水腫的形成,這將為缺血再灌注后腦水腫的臨床治療提供一個新的方法,但其具體機制尚需進一步研究。
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R74
A
1005-9202(2012)12-2567-02;
10.3969/j.issn.1005-9202.2012.12.055
1 鄭州大學護理學院臨床教研室 2 河南大學第一附屬醫(yī)院藥劑科
楊霄鵬(1973-),男,副主任醫(yī)師,碩士生導師,主要從事腦血管病及神經(jīng)免疫性疾病研究。
〔2012-01-05收稿 2012-01-28修回〕
(編輯 袁左鳴)