楊霄鵬 李秋芳 楊瑞玲 (鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州 45004)

丁苯酞預(yù)處理對(duì)抗大鼠腦缺血再灌注損傷后腦水腫的作用機(jī)制

楊霄鵬 李秋芳1楊瑞玲2(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州 450014)

目的探討丁苯酞對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。方法96只健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血再灌注組、丁苯酞(NBP)干預(yù)組，各組按再灌注6、24、48、72 h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)分為4個(gè)亞組，每組8只。采用線栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型，HE染色觀察腦組織形態(tài)病理學(xué)變化，免疫組化法測(cè)定大鼠腦缺血再灌注不同時(shí)間水通道蛋白-4(AQP-4)的表達(dá)，干濕重法測(cè)定同側(cè)腦組織的含水量。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組AQP-4及含水量在缺血再灌注6 h明顯升高，于48 h達(dá)到峰值(P＜0.05);NBP預(yù)處理組AQP-4陽性表達(dá)與含水量在各時(shí)間點(diǎn)明顯增加但低于缺血再灌注組(P＜0.05)。結(jié)論NBP預(yù)處理可降低腦缺血再灌注損傷大鼠AQP-4的表達(dá)，有效防治腦缺血再灌注損傷后腦水腫的形成。

丁基苯酞;缺血再灌注;腦水腫

水通道蛋白(AQPs)是影響水跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的一種膜蛋白，AQP-4是其家族中的一員，廣泛分布于腦膠質(zhì)細(xì)胞、室管膜細(xì)胞以及毛細(xì)血管周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞足突上〔1〕。AQP-4在缺血性腦水腫的產(chǎn)生和發(fā)展過程中起重要作用〔2〕。丁苯酞(NBP)對(duì)缺血性腦卒中具有肯定的治療作用，但其抗缺血的具體機(jī)制目前尚未明確。本文旨在探討NBP是否通過調(diào)節(jié)缺血再灌注大鼠腦組織AQP-4的表達(dá)，進(jìn)而減輕腦水腫，從而為NBP臨床治療腦缺血再灌注損傷提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康雄性Wistar大鼠96只，體質(zhì)量240～280 g，由鄭州大學(xué)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為假手術(shù)組，缺血再灌注組，NBP治療組。每組按再灌注后6、24、48、72 h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)分為4個(gè)亞組，每組8只。

1.2 藥物和主要試劑 NBP由石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司提供，批號(hào)09110611。以0.5%Tween80制成10 mg/m l混懸液用于整體動(dòng)物腹腔注射。AQP-4試劑盒(武漢博士德生物有限公司)，鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接(SP)法免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 給藥方法 假手術(shù)組不給藥。治療組于再灌注同時(shí)腹腔注射NBP 80 mg/kg，模型組再灌注同時(shí)予等劑量生理鹽水。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立 改良線栓法制作大鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞腦缺血模型。10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥固定，常規(guī)消毒，取頸部正中切口，分離并暴露左側(cè)頸總及頸內(nèi)、外動(dòng)脈。分離迷走神經(jīng)，結(jié)扎左側(cè)頸總及頸外動(dòng)脈根部，由左側(cè)頸總動(dòng)脈分叉處剪一小口插入頭端燒圓、涂蠟、呈鈍形的直徑為0.245 mm的尼龍魚線，線栓插入深度約18～20 mm，感有輕微阻力時(shí)停止，扎緊并固定栓線，縫合皮膚，阻斷血流2 h后，抽提栓線至頸總動(dòng)脈內(nèi)實(shí)現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組除不插入尼龍魚線外，其余步驟同手術(shù)組。選擇蘇醒后右上肢屈曲、行走時(shí)向右側(cè)旋轉(zhuǎn)或右側(cè)肢體癱瘓的大鼠造模成功者進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 SP法測(cè)定AQP-4 各個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，0.9%生理鹽水250 ml心內(nèi)灌注沖洗，后用4%多聚甲醛溶液固定，取視交叉前后2 mm的大腦組織，多聚甲醛溶液固定72 h，常規(guī)脫水，石蠟包埋，冠狀切片，切片水化后，過氧化物酶阻斷，熱抗原修復(fù)，滴加一抗過夜，滴加二抗，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素伊紅(HE)染色，二甲苯透明，中性樹膠封片。采用Biosens Digital Imaging System(上海山富科學(xué)儀器有限公司)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析，每只大鼠共染色5張切片，在光學(xué)顯微鏡下，隨機(jī)對(duì)免疫組化的每張切片選取5個(gè)區(qū)域進(jìn)行觀察。

1.3.4 腦組織含水量的測(cè)定 采用干濕重法測(cè)定腦組織含水量，動(dòng)物迅速斷頭取腦，取進(jìn)針點(diǎn)后腦組織約100 mg，電子天平先稱取濕重，放入電熱恒溫培養(yǎng)干燥兩用箱100℃烘烤48 h，再稱取干重。腦組織含水量=(濕重－干重)/濕重×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料均以±s表示，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，任意兩組之間的比較采用LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 腦組織形態(tài)學(xué)的改變 假手術(shù)組缺血側(cè)腦組織HE染色細(xì)胞形態(tài)無異常。缺血再灌注組:再灌注6 h神經(jīng)細(xì)胞胞體腫脹;再灌注24～48 h腦組織梗死灶結(jié)構(gòu)疏松，可見間質(zhì)水腫，周圍出現(xiàn)部分細(xì)胞核固縮濃染，核碎裂、核溶解;再灌注72 h后細(xì)胞腫脹減輕，有少量膠質(zhì)細(xì)胞增生。NBP預(yù)處理組病理改變輕微，較少神經(jīng)元變性壞死。見圖1。

2.2 AQP-4的動(dòng)態(tài)變化 再灌注6 h后神經(jīng)細(xì)胞AQP-4陽性表達(dá)增加不明顯，24 h AQP-4陽性表達(dá)明顯增加，48 h達(dá)到高峰，72 h后仍強(qiáng)于正常。AQP-4的陽性表達(dá)位于細(xì)胞膜、血管周圍，陽性表達(dá)呈棕黃色。假手術(shù)組神經(jīng)細(xì)胞AQP-4呈弱陽性表達(dá)。見表1。

表1 各組大鼠再灌注不同時(shí)點(diǎn)腦組織AQP-4平均灰度值(±s，n=8)

表1 各組大鼠再灌注不同時(shí)點(diǎn)腦組織AQP-4平均灰度值(±s，n=8)

與假手術(shù)組比較:1)P＜0.05;與前一時(shí)間比較:2)P＜0.05;與缺血再灌注組比較:3)P＜0.05;下表同

組別6 h 24 h 48 h 72 h假手術(shù)組 16.28±4.88 16.67±4.92 16.89±4.82 15.99±4.74缺血再灌注組 42.96±5.211) 53.88±4.651)2) 65.69±4.061)2) 59.06±5.231)2)NBP處理組 31.76±6.341)3) 41.97±5.331)2) 52.84±4.821)2)46.78±5.261)2)

2.3 腦組織含水量的變化 再灌注后6 h開始出現(xiàn)腦水腫，48 h腦組織含水量達(dá)到高峰，72 h后逐漸消退。見表2。

表2 各組大鼠再灌注不同時(shí)點(diǎn)腦組織含水量的變化(±s，n=8)

表2 各組大鼠再灌注不同時(shí)點(diǎn)腦組織含水量的變化(±s，n=8)

組別6 h 24 h 48 h 72 h假手術(shù)組 76.35±0.32 76.41±0.34 76.39±0.40 76.21±0.29缺血再灌注組 78.72±0.571) 81.44±1.031)2) 82.98±1.261)2) 80.13±0.741)2)NBP處理組 77.56±0.491)2)79.03±0.941)2)3)80.11±0.971)2)3)78.26±0.521)2)3)

圖1 HE染色觀察各組大鼠腦組織形態(tài)學(xué)改變

3 討論

缺血性腦血管病后腦水腫可引起顱高壓，加重病情，甚至導(dǎo)致患者死亡，但其發(fā)生的機(jī)制尚不十分清楚。近年來研究表明，水分子的轉(zhuǎn)運(yùn)需要通過AQPs來調(diào)節(jié)，其在腦水腫形成中的作用成為臨床尋找治療腦水腫的新熱點(diǎn)。目前發(fā)現(xiàn)AQPs家族共有13種，AQP-4在腦組織中分布最廣，主要分布在星形膠質(zhì)細(xì)胞膜表面，特別是血管周圍的膠質(zhì)細(xì)胞突起上，對(duì)腦內(nèi)水代謝平衡起重要調(diào)節(jié)作用，與腦水腫發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔3〕。

NBP為人工合成的消旋體，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，NBP能夠保護(hù)線粒體、改善細(xì)胞能量代謝、增加腦缺血區(qū)的血流量〔4〕，可明顯縮小局部腦缺血的梗死面積，對(duì)缺血性腦梗死具有肯定的治療作用〔5〕。NBP預(yù)處理在防治腦缺血再灌注損傷后腦水腫的作用研究報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)中觀察到缺血再灌注后6 h腦組織含水量增加，隨著再灌注時(shí)間延長，腦組織含水量進(jìn)一步增多，48 h達(dá)高峰，72 h后開始降低。與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果基本一致〔6〕。缺血再灌注后的不同時(shí)間點(diǎn)，缺血區(qū)AQP-4表達(dá)程度也不同。再灌注6 h后AQP-4表達(dá)增強(qiáng)，24～48 h表達(dá)呈強(qiáng)陽性，72 h開始下降，與水腫程度及神經(jīng)細(xì)胞損傷程度一致。NBP預(yù)處理組各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)細(xì)胞損傷程度、水含量及AQP-4的表達(dá)強(qiáng)度均較缺血再灌注組降低但仍高于假手術(shù)組。說明NBP預(yù)處理后可能通過某種途徑抑制AQP-4的表達(dá)，從而防治腦缺血再灌注損傷后腦水腫的形成，這將為缺血再灌注后腦水腫的臨床治療提供一個(gè)新的方法，但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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R74

A

1005-9202(2012)12-2567-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.12.055

1 鄭州大學(xué)護(hù)理學(xué)院臨床教研室 2 河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科

楊霄鵬(1973-)，男，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事腦血管病及神經(jīng)免疫性疾病研究。

〔2012-01-05收稿 2012-01-28修回〕

(編輯 袁左鳴)