趙星趙松楊洋

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科 河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450052)

自噬基因 Beclin1在人肺腺癌A549細(xì)胞系SP及非SP細(xì)胞亞群中的表達(dá)

趙星趙松楊洋

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科 河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450052)

目的探討自噬基因Beclin1在人肺腺癌A549細(xì)胞系SP及非SP細(xì)胞亞群中的表達(dá)。方法用流式細(xì)胞學(xué)方法分選人肺腺癌A549細(xì)胞系中SP細(xì)胞及非SP細(xì)胞亞群，采用Western印跡方法檢測Beclin1蛋白在SP細(xì)胞及非SP細(xì)胞亞群的表達(dá)情況。結(jié)果流式細(xì)胞學(xué)方法成功分選得到SP細(xì)胞及非SP細(xì)胞亞群，Western印跡檢測Beclin1蛋白在SP細(xì)胞亞群中的相對表達(dá)量為2.795±0.090，在非SP細(xì)胞亞群中的相對表達(dá)量為3.048±0.124，兩組表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.220，P＜0.05)。結(jié)論自噬相關(guān)基因Beclin1在人肺腺癌A549細(xì)胞系SP細(xì)胞亞群中的表達(dá)較非SP細(xì)胞下降，這可能與SP細(xì)胞亞群具有的腫瘤干細(xì)胞特性有關(guān)。

自噬;Beclin1;側(cè)群干細(xì)胞;肺癌

目前，普遍認(rèn)為腫瘤起源于腫瘤干細(xì)胞，腫瘤干細(xì)胞具有和普通干細(xì)胞相似的特性〔1〕，雖然在腫瘤中占極小的比例，卻是腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的根源。對側(cè)群干細(xì)胞(SP)進(jìn)行研究以獲取腫瘤干細(xì)胞的相關(guān)特性是目前的研究熱點(diǎn)與常用方法。自噬性死亡為Ⅱ型程序性死亡，同時作為一種應(yīng)急機(jī)制也與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)一些抑瘤作用與自噬及自噬性死亡存在一定的關(guān)系〔2〕。Beclin1是編碼自噬相關(guān)蛋白的重要基因，已有研究報(bào)道該基因在肺癌組織中的表達(dá)較正常肺組織下調(diào)〔3〕。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 人肺腺癌A549細(xì)胞系(鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院實(shí)驗(yàn)室)，胎牛血清(杭州四季青生物工程公司)。RPMI1640培養(yǎng)基(北京索來寶試劑公司)，Hoechest33342、維拉帕米(Verapamil)、碘化丙啶(PI)(美國Sigma公司)，Beclin1一抗(兔抗人，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，β-肌動蛋白(βactin)北京中杉金橋生物公司。

1.2 方法 細(xì)胞培養(yǎng)用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng);0.02%EDTA和0.25%胰蛋白酶的1∶1混合液消化、傳代。實(shí)驗(yàn)采用對數(shù)生長期細(xì)胞。

1.3 細(xì)胞分選 選擇對數(shù)生長期細(xì)胞，離心棄原培養(yǎng)液后，加入預(yù)熱至37℃的含2%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度至1×106/ml;準(zhǔn)備干燥標(biāo)準(zhǔn)流式上樣管(5 ml規(guī)格，聚丙烯材料)，兩管中分別加入上述細(xì)胞懸液1 ml，同時加入Hoeehst33342溶液至終濃度為5μg/m l，在對照管加入Verapamil，使終濃度為50μg/ml;充分吹打均勻后封口，置于已預(yù)熱至37℃恒溫?fù)u床作用120 min，混勻溶液使細(xì)胞充分染色;染色完成后，兩試管中立即加入預(yù)備的4℃磷酸鹽緩沖液(PBS)終止反應(yīng);4℃，1 200 r/min離心5 min，小心棄上清，重懸于4℃含2%胎牛血清的PBS溶液中。加入PI至終濃度為1 mg/L，上流式細(xì)胞儀檢測、分選細(xì)胞。Hoechst33342的激發(fā)光為346 nm紫外光，424/44帶通收集藍(lán)光，630/22帶通收集紅光。PI的激發(fā)光為488 nm藍(lán)光，用575/26帶通收集紅光。

1.4 SP和非SP亞群細(xì)胞的熒光比較 取分選后的SP和非SP細(xì)胞懸液各1μl置于載玻片上，分別在光鏡和熒光顯微鏡下觀察，比較SP和非SP亞群細(xì)胞形態(tài)差異、熒光強(qiáng)弱。

1.5 Western印跡檢測 用 RIPA buffer 200μl裂解細(xì)胞，應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)，通過測量吸光度值進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)印和封閉后，加入Beclin1抗體(1∶1 000)，4℃過夜，洗膜后加入堿性磷酸酶標(biāo)記二抗(1∶3 000)，室溫孵育1 h，電化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯影，X光片暗室中曝光、顯影。以β-actin作為內(nèi)參對照，將膠片進(jìn)行掃描后以目的蛋白的灰度值與內(nèi)參的灰度值比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS11.0軟件，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

圖1 流式細(xì)胞儀分選SP及非SP細(xì)胞亞群

2.1 流式細(xì)胞儀分選SP及非SP細(xì)胞亞群 見圖1。人肺癌細(xì)胞經(jīng)Hoechst33342及PI染色標(biāo)記，對照管加入Verapamil后，上流式細(xì)胞儀分選得到Hoechest33342陰性/弱陽性細(xì)胞亞群(SP細(xì)胞亞群)和Hoechest33342陽性細(xì)胞亞群(非SP細(xì)胞亞群)，前者約占活細(xì)胞總數(shù)的1.10%;由于Verapamil可以阻斷SP排出Hoechest33342，經(jīng)Verapamil處理后對照管SP亞群細(xì)胞含量下降為0.20%。

2.2 SP和非SP亞群細(xì)胞的熒光比較 在熒光顯微鏡下觀察可見SP發(fā)出微弱的藍(lán)光;光鏡下觀察SP，同一視野下，SP與非SP亞群細(xì)胞形態(tài)無明顯區(qū)別。見圖2。

圖2 熒光鏡及光鏡下觀察SP、非SP細(xì)胞

2.3 Western印跡方法檢測Beclin1在SP及非SP亞群細(xì)胞中的表達(dá) Beclin1在SP細(xì)胞及非SP細(xì)胞中的相對表達(dá)量分別為2.795±0.090，3.048±0.120，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.220，P ＜0.05)。

3 討論

近年來，肺癌的發(fā)病率和死亡率有明顯增高的趨勢，盡管其早期診斷與治療取得了明顯的進(jìn)展，但總體治療效果并沒有顯著提高，5年生存率依然很低。主要原因是腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性十分復(fù)雜，惡性程度較高，缺乏有效的根治手段，常規(guī)治療治愈率低，轉(zhuǎn)移率及病死率高，預(yù)后差。因此，目前對它的癌變機(jī)制研究及從細(xì)胞層面進(jìn)行有效的臨床治療的方法的探索受到國內(nèi)外學(xué)者的高度關(guān)注〔4〕。

自噬及其與腫瘤的關(guān)系逐步成為腫瘤研究的熱點(diǎn)和新方向。自噬究竟是促進(jìn)腫瘤的發(fā)生〔5〕，還是抑制腫瘤的發(fā)展〔6〕，不同的研究有不同的結(jié)論，學(xué)者尚未有統(tǒng)一的認(rèn)識。目前已有研究報(bào)道自噬相關(guān)基因Beclin1在肺癌組織中的表達(dá)與癌旁組織和正常肺組織中的表達(dá)相比是下調(diào)的，認(rèn)為在肺癌細(xì)胞中，自噬作用被抑制，蛋白降解減少〔7〕，降解產(chǎn)物為腫瘤細(xì)胞提供營養(yǎng)及能量;同時自噬作用清除了抗腫瘤治療的一部分作用，共同作用從而保護(hù)并促進(jìn)肺癌的發(fā)展惡化〔8〕。但自噬作用在肺癌細(xì)胞中的SP細(xì)胞亞群及非SP細(xì)胞亞群中的表達(dá)是下調(diào)還是上升，尚未見報(bào)道。通過本文的研究發(fā)現(xiàn)，自噬基因 Beclin1在肺癌SP細(xì)胞亞群中的表達(dá)與非SP細(xì)胞亞群中的表達(dá)相比下調(diào)。通過Beclin1這一自噬基因的指示效應(yīng)，可表明SP細(xì)胞亞群的自噬作用低于非SP細(xì)胞亞群。

SP細(xì)胞亞群中富含腫瘤干細(xì)胞〔9〕，同樣也有學(xué)者提出異議〔10〕。有研究認(rèn)為雖然手術(shù)切除了瘤組織、放化療清除了大量腫瘤細(xì)胞，但由于對放化療的抵抗性，少量的腫瘤干細(xì)胞仍然存在于機(jī)體。其通過一系列復(fù)雜的無序的增殖分化過程，又有大量的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生，即腫瘤的復(fù)發(fā)。此觀點(diǎn)可以解釋腫瘤放化療效果不佳、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等問題〔11〕。肺腺癌中SP細(xì)胞亞群的自噬作用低，可能與腫瘤干細(xì)胞的分化增殖能力強(qiáng)等有關(guān)〔12〕。臨床上，如果通過某些藥物特定針對SP細(xì)胞亞群的自噬作用，達(dá)到使SP細(xì)胞亞群自噬作用降低甚至消失，再通過手術(shù)或放化療作用清除腫瘤細(xì)胞以達(dá)到治療目的;或者通過上調(diào)作用而過度自噬使SP細(xì)胞亞群死亡，則人肺癌的治療將發(fā)生根本性的變革，甚至完全治愈，同時對其他腫瘤的治療也起到借鑒作用。近來已有研究發(fā)現(xiàn)，使用雷帕霉素可使SP亞群細(xì)胞的自噬作用上調(diào)〔13〕，但該藥物與患者的生存分析仍有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)和研究。本文通過Western印跡檢測自噬基因Beclin1在人肺腺癌細(xì)胞中SP及非SP細(xì)胞亞群中的表達(dá)，對肺癌的認(rèn)識和治療提出新的設(shè)想和展望，但真正應(yīng)用于臨床治療仍需進(jìn)一步的研究。

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R734.2

A

1005-9202(2012)12-2559-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.12.052

趙 松(1962-)，男，碩士生導(dǎo)師，教授，主任醫(yī)師，主要從事胸部腫瘤的基礎(chǔ)與臨床研究。

趙 星(1984-)，男，在讀碩士，主要從事胸部腫瘤基礎(chǔ)與臨床研究。

〔2011-10-11收稿 2011-02-16修回〕

(編輯 袁左鳴)