劉東璞 盧鳳美 王明富 孟慶媛 郭夢(mèng)凡 姚海濤 王 抒

(佳木斯大學(xué)司法鑒定中心，黑龍江 佳木斯 154007)

紅景天對(duì)大鼠肝纖維化肝臟組織中TIMP-1、Smad4表達(dá)的影響

劉東璞 盧鳳美 王明富 孟慶媛 郭夢(mèng)凡 姚海濤 王 抒

(佳木斯大學(xué)司法鑒定中心，黑龍江 佳木斯 154007)

目的探討紅景天對(duì)四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化肝組織基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP-1)、Smad4基因表達(dá)的影響。方法健康雄性SD大鼠60只隨機(jī)分為①正常對(duì)照組、②肝纖維化模型組、③紅景天干預(yù)組，每組20只。以CCl4腹腔注射法誘導(dǎo)大鼠肝纖維化，紅景天干預(yù)組大鼠在造模的同時(shí)給予紅景天灌胃，正常對(duì)照組給予橄欖油和生理鹽水灌胃，8 w實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)處死動(dòng)物，留取的肝臟組織做HE染色，按0～4期標(biāo)準(zhǔn)判定肝纖維化程度，應(yīng)用半定量RT-PCR檢測(cè)肝組織中TIMP-1 mRNA、Smad4 mRNA的表達(dá)情況，用免疫組化檢測(cè)肝組織中TIMP-1、Smad4的表達(dá)。結(jié)果模型組大鼠肝纖維化程度處于2～4期，其中大部分達(dá)3期以上，紅景天干預(yù)組大鼠肝纖維化程度明顯減輕，只有少部分達(dá)3期。紅景天干預(yù)組大鼠肝組織中TIMP-1 mRNA陽性表達(dá)水平及蛋白陽性表達(dá)均低于模型組(P＜0.05);紅景天干預(yù)性治療組肝臟Smad4 mRNA及蛋白表達(dá)陽性率明顯低于模型組(P＜0.05);肝組織TIMP-1，Smad4蛋白表達(dá)與TIMP-1，Smad4 mRNA水平變化呈正相關(guān)。結(jié)論中藥紅景天能有效抑制CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝臟中TIMP-1、Smad4表達(dá)。

紅景天;肝纖維化;TIMP-1;Smad4

肝纖維化是多種慢性肝臟疾病發(fā)展為肝硬化的重要環(huán)節(jié)，有效控制肝纖維化進(jìn)展具有極為重要的臨床意義。紅景天具有保護(hù)肝細(xì)胞、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等多種功效，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有良好的干預(yù)四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的肝纖維化作用?；|(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMPs)是肝纖維化過程中的關(guān)鍵因子，具有抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)活性的功能，可與MMPs非共價(jià)結(jié)合而抑制其活性，也可與酶原結(jié)合阻止其活化，其在肝組織中的表達(dá)水平可以反映肝組織纖維化程度〔1，2〕。Smads是一族傳遞TGFβ信號(hào)的分子，其中Smad4為傳遞信息必須的共用Smad分子，干擾或阻斷該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，有可能阻止肝纖維化進(jìn)程〔3〕。本文檢測(cè)CCl4誘導(dǎo)肝纖維化大鼠肝組織中TIMP-1、Smad4基因的表達(dá)，觀察紅景天對(duì)CCl4中毒性大鼠肝纖維化模型膠原代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠60只，體重180～220 g，由佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。CCl4購自天津石英釧廠霸州市化工廠分廠。復(fù)方紅景天膠囊購自福州恒豐量子生物科技有限公司。組織RNA提取試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為立陶宛MBI公司產(chǎn)品。TIMP-1、Smad4上下游引物及兔抗大鼠 TIMP-1、Smad 4的一抗由上海生物工程公司生產(chǎn)。辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的免疫組化通用型羊抗兔的二抗工作液由北京中山生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 分組 隨機(jī)分組:①正常對(duì)照組;②肝纖維化模型組;③紅景天干預(yù)組，每組20只，各組間暴露因素?zé)o差別(P＞0.05)。用CCl4腹腔注射法誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型，即用100 ml/L CCl4(橄欖油稀釋)1 m l/kg，1次/w，共8 w。紅景天干預(yù)組在造模的同時(shí)給予紅景天灌胃(濃度40 g/L，劑量10 m l/kg，2次/w，共8 w)，肝纖維化模型組造模同時(shí)予生理鹽水灌胃，正常對(duì)照組予等量橄欖油和生理鹽水處理。各組大鼠在最后一次CCl4注射后48 h處死，部分肝臟用4%甲醛固定，留做病理檢查，其余標(biāo)本迅速放到－80℃冰箱保存。

1.2.2 常規(guī)病理學(xué)檢查 病理學(xué)切片用HE染色，按2000年西安會(huì)議由中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲病學(xué)分會(huì)、肝病學(xué)分會(huì)聯(lián)合修訂的慢性肝炎分級(jí)分期標(biāo)準(zhǔn)判定肝纖維化程度〔3〕。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)肝組織中TIMP-1、Smad4 mRNA TRIzol一步法提取組織總RNA，總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR反應(yīng)。取10μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入25 g/L溴乙錠瓊脂糖凝膠中，以80 V/cm電壓電泳50 min，在紫外線下可見相應(yīng)長(zhǎng)度的目的基因和內(nèi)參的擴(kuò)增條帶，將電泳結(jié)果直接置于凝膠分析系統(tǒng)中對(duì)條帶進(jìn)行分析。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫，應(yīng)用Primer-3軟件設(shè)計(jì)目的基因的擴(kuò)增引物:TIMP-1:上游:5'-CTTCCACAGGTCCCACAA-3'，下游:5'-CAGCCCTGGCTCCCGAGG-3'，長(zhǎng)度 238 bp;GAPDH:上游:5'-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3'，下 游:5'-AGGGGTCTACATGGCAACTG-3'，長(zhǎng)度500 bp。采用25 μl的反應(yīng)體系。其中GAPDH與目的基因的引物濃度均為1μmol/L。TIMP-1 反應(yīng)條件分別是:94℃ 2 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃50 s，28個(gè)循環(huán)(經(jīng)多次預(yù)試驗(yàn)摸索最佳實(shí)驗(yàn)條件);72℃7 min;Smad 4:上游:5'-TGCAGGTGGCTGGTCGGAAAG-3'，下游:5'-AGGATGATTGGAAATGGGAGGCTG-3'，長(zhǎng)度 710 bp，反應(yīng)條件分別是:94℃ 2 min，94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 50 s，28 個(gè)循環(huán);72℃ 7 min;PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后用Bio-RadGel Doc2000型凝膠成像系統(tǒng)照相并用QuangtityOne軟件計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)值。

1.2.4 免疫組化檢測(cè)肝組織中TIMP-1，Smad4 用3'，3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)二步法檢測(cè)肝組織中TIMP-1、Smad4，方法:石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水。用30 m l/L H2O2消除內(nèi)源性過氧化氫酶。以檸檬酸鹽工作緩沖液微波熱修復(fù)。用100 m l/L正常山羊血清封閉非特異性抗原。滴加1∶200的一抗，4℃孵育過夜，滴加適量的二抗(HRP標(biāo)記)工作液，37℃孵育20 min，DAB顯色，蘇木素液復(fù)染，封片。以磷酸鹽緩沖液代替第一抗體作陰性對(duì)照。對(duì)陽性染色采用HPIAS-2000型高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度分析，按照Weidner方法，雙盲法閱片，先在低倍鏡下選擇陽性結(jié)果密集區(qū)域，然后在高倍視野下自動(dòng)計(jì)算A值，取平均值計(jì)為該切片的A值。

2 結(jié)果

2.1 各組肝纖維化分期 用CCl4反復(fù)腹腔注射至第8周，模型組大鼠均形成肝纖維化或早期肝硬化，纖維化程度在2～4期之間，20只大鼠中有14只在3期以上，而紅景天防治組大鼠肝纖維化程度較模型組減輕。

2.2 大鼠肝組織TIMP-1表達(dá) 模型組大鼠肝組織TIMP-1 mRNA的水平較正常組顯著增高(P＜0.05);紅景天干預(yù)組大鼠肝組織中TIMP-1 mRNA的水平較模型組顯著降低(P＜0.05)。在正常組織切片中可見肝組織中TIMP-1呈微弱水平表達(dá)，陽性信號(hào)主要見于肌成纖維細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞中。模型組中TIMP-1的表達(dá)較正常對(duì)照組顯著增強(qiáng)，陽性表達(dá)以匯管區(qū)及纖維間隔中最明顯，主要表現(xiàn)為胞質(zhì)著色，同時(shí)在纖維間隔內(nèi)也可見，其A值與正常對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。紅景天干預(yù)組大鼠肝組織中TIMP-1的陽性率低于模型組，其A值相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表 1，圖 1，圖 2。

2.3 大鼠肝組織Smad4表達(dá) RT-PCR檢測(cè)正常肝組織未見明顯Smad4 mRNA陽性表達(dá)細(xì)胞，模型組大鼠肝組織Smad4 mRNA的水平較正常組顯著增高(P＜0.01);紅景天干預(yù)組大鼠肝組織中Smad4 mRNA的水平較模型組顯著降低(P＜0.05)。免疫組化染色可見正常大鼠肝組織未檢出明顯的Smad4表達(dá)，模型組大鼠肝組織Smad4表達(dá)明顯增加，棕黃色陽性顆粒定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，陽性細(xì)胞集中于匯管區(qū)，以梭狀的間質(zhì)細(xì)胞為主，肝細(xì)胞未見明確陽性反應(yīng)。紅景天干預(yù)組大鼠肝組織Smad4表達(dá)較模型組明顯減少，陽性細(xì)胞亦主要位于匯管區(qū)，以間質(zhì)細(xì)胞為主。各組陰性對(duì)照未見陽性表達(dá)，證實(shí)免疫組化和RT-PCR檢測(cè)結(jié)果具有特異性。見表2，圖3，圖4。

表1 肝組織TIMP-1表達(dá)的變化(±s，n=20)

表1 肝組織TIMP-1表達(dá)的變化(±s，n=20)

與模型組比較:1)P＜0.05

組別TIMP-1 TIMP-1 mRNA正常組 0.121±0.0671) 0.615±0.0671)模型組 0.356±0.052 0.858±0.052干預(yù)組 0.213±0.0301) 0.695±0.0301)

圖1 肝組織中TIMP-1 mRNA表達(dá)的變化

表2 肝組織Smad 4表達(dá)的變化(±s，n=20)

表2 肝組織Smad 4表達(dá)的變化(±s，n=20)

與模型組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

組別Smad4 Smad4 mRNA正常組 02) 02)模型組 0.117±0.080 0.632±0.091干預(yù)組 0.053±0.0102) 0.253±0.0181)

圖2 肝組織中TIMP-1表達(dá)(×100)

圖3 肝組織中Smad4 mRNA表達(dá)的變化

圖4 肝組織中Smad4表達(dá)(×100)

3 討論

近年來，分子病理學(xué)、分子生物學(xué)、分子藥理學(xué)等學(xué)科的快速發(fā)展使人們對(duì)肝纖維化發(fā)生機(jī)制的認(rèn)識(shí)不斷深化，肝星狀細(xì)胞(HSC)是肝組織內(nèi)生成膠原纖維等細(xì)胞外基質(zhì)的主要細(xì)胞來源，HSC的激活是造成肝纖維化的中心環(huán)節(jié)〔4〕。TIMP-1雖然不是肝纖維化的始發(fā)因素，但在肝纖維化的發(fā)展過程中起重要的促進(jìn)作用，在肝臟受損后，通過一系列細(xì)胞因子的作用激活HSC。TIMP-1大量表達(dá)可以在酶原活化階段與MMPs形成穩(wěn)定復(fù)合體，阻礙MMPs酶原自我激活，也可在活化的酶原階段與活化的 MMPs形成 1∶1復(fù)合體，抑制其活性〔5，6〕。

TGFβ-Smad信號(hào)通路是肝纖維化時(shí)主要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路〔7～9〕，Smads是一族傳遞 TGFβ 信號(hào)的分子，其中與受體結(jié)合的是Smad2、3，具有抑制作用的是Smad6、7，Smad4則為傳遞信息必須的共用Smad分子，阻斷或干擾該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有可能阻止肝纖維化進(jìn)程〔3〕。

通過多年的基礎(chǔ)與臨床研究證實(shí)中藥紅景天具有抗慢性肝炎肝纖維化作用，其作用機(jī)制包括抑制HSC的增殖與活化，抑制膠原纖維的表達(dá)，減輕肝臟炎癥。本文結(jié)果顯示紅景天可以較好防治 CCl4損傷性肝纖維化，使大鼠肝組織 TIMP-1、Smad4的表達(dá)減少，明顯低于模型組，高于正常對(duì)照組。這就表明紅景天具有通過抑制TIMP-1、Smad4的表達(dá)，保護(hù)纖維化肝組織內(nèi)包括HSC在內(nèi)的細(xì)胞周圍正常的基底膜樣細(xì)胞間質(zhì)，對(duì)于抑制HSC的活化與肝纖維化的發(fā)展具有重要意義，同時(shí)減弱Smad4基因的表達(dá)，從而有效地干預(yù)了TGFβ介導(dǎo)的肝纖維化信號(hào)傳導(dǎo)過程，可能是其抗肝纖維化分子機(jī)制之一。

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R57

A

1005-9202(2012)12-2556-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.12.051

黑龍江省衛(wèi)生廳科研資助項(xiàng)目(No.2009-355)

盧鳳美(1970-)，女，碩士，副教授，主要從事肝臟疾病的防治與預(yù)防的研究。

劉東璞(1969-)，男，碩士生導(dǎo)師，副教授，主要從事肝纖維化研究。

〔2011-09-26收稿 2011-12-25修回〕

(編輯 張永貴/胡國(guó)義)