顧 明 馬鴻雁 李玉芹 車(chē)兆梅 于維漢 (北華大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科，吉林 吉林 320)

卡托普利預(yù)處理對(duì)急性心肌損傷大鼠CT-1mRNA和gp130 mRNA表達(dá)的影響及意義

顧 明 馬鴻雁 李玉芹 車(chē)兆梅 于維漢1(北華大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科，吉林 吉林 132011)

目的研究心肌營(yíng)養(yǎng)素1(CT-1)及其受體gp130在異丙基腎上腺素(Iso)致大鼠急性心肌損傷中的保護(hù)作用。方法將Wistar雄性大白鼠隨機(jī)分為3組:對(duì)照組、Iso損傷組，卡托普利(Cap)預(yù)處理組;用光鏡觀察心肌組織的病理變化，用生化方法檢測(cè)心肌酶，用RT-PCR方法檢測(cè)心肌組織CT-1 mRNA、gp130 mRNA的表達(dá)。結(jié)果Cap預(yù)處理組與Iso損傷組比較，心肌壞死面積減小，肌酸激酶(CK)、谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(GOT)、乳酸脫氫酶(LDH)降低，CT-1 mRNA和gp130 mRNA表達(dá)增高(P＜0.01，P＜0.05)。結(jié)論Cap預(yù)處理可能通過(guò)促進(jìn)CT-1的表達(dá)保護(hù)心肌。

異丙基腎上腺素;卡托普利;心肌營(yíng)養(yǎng)素1;心肌;大鼠

心肌營(yíng)養(yǎng)素1(CT-1)屬白細(xì)胞介素-6(IL-6)家族成員。CT-1與其特異性受體人糖蛋白(gp130)結(jié)合后，可促進(jìn)未成熟心肌細(xì)胞的存活和增殖，具有心肌保護(hù)作用〔1〕?？ㄍ衅绽?Cap)則可通過(guò)缺血預(yù)適應(yīng)減輕心肌損傷〔2〕。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)給大鼠腹腔注射異丙基腎上腺素(Iso)，建立了急性心肌損傷的動(dòng)物模型，其病理特點(diǎn)、電生理等變化與缺血型心臟病類(lèi)似。本文首次探討了血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)的心肌保護(hù)作用是否與CT-1及其受體gp130的表達(dá)上調(diào)有關(guān)，從而為臨床上如何干預(yù)CT-1的表達(dá)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及預(yù)處理 健康雄性Wistar大鼠60只，體重180～200 g(由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，均食用普通飼料，飲普通水。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為三組:Iso損傷組(n=20);Cap預(yù)處理組(n=20);生理鹽水對(duì)照組(n=20)。Iso損傷組:腹腔注射 Iso 5.0 mg/kg，1次/d，連續(xù)3 d，注射前一天生理鹽水3 m l灌胃，連續(xù)3 d;Cap預(yù)處理組:腹腔注射Iso，方法同Iso損傷組，卡托普利100 mg/kg灌胃，連續(xù)3 d;對(duì)照組:等劑量的生理鹽水注射及灌胃。末次注藥后24 h處死動(dòng)物，按實(shí)驗(yàn)要求取材。

1.2 心肌組織病理學(xué)分析 取心肌標(biāo)本制作石蠟切片，HE染色后觀察形態(tài)學(xué)改變。心肌損傷程度用北京航空航天大學(xué)真彩色病理圖像分析系統(tǒng)測(cè)量心肌壞死灶面積和心肌總面積，并計(jì)算二者的百分比。

1.3 血清心肌酶測(cè)定 用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定肌酸激酶(CK)、谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(GOT)、乳酸脫氫酶(LDH)。

1.4 心肌組織CT-1 mRNA和gp130 mRNA表達(dá)的檢測(cè)

1.4.1 總RNA提取 常規(guī)Trizol提取，總RNA溶解在10μl無(wú)RNA酶的水中，70℃水浴10 min，冰浴5 min，紫外分光比色測(cè)樣品RNA的量。

1.4.2 逆轉(zhuǎn)錄 反應(yīng)體系構(gòu)成:10倍緩沖液2μl、10 mmol/L dNTP 2 μl、Rnasin 0.5 μl、AMV 0.7 μl、Oligo(dT)15引物 1 μl、模板2μg，加無(wú) RNA酶水補(bǔ)足至20μl?；靹蚝?2℃水浴40 min;95℃水浴5 min。

1.4.3 PCR擴(kuò)增 將 CT-1 mRNA、gp130 mRNA和內(nèi)對(duì)照β-actin mRNA分別進(jìn)行擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的cDNA。CT-1 mRNA和gp130 mRNA反應(yīng)體系構(gòu)成:Taq 0.1 ml、10倍緩沖液2μl、2.5 mmol/L dNTP 2 μl、CT-1 引物或 gp130 引物 1 m l、模板1 ml、余量以蒸餾水補(bǔ)足體積至20 m l;反應(yīng)參數(shù)為94℃ 5 min，94℃變性 30 s，52℃ 退火 45s，72℃ 延伸 45 s，35 循環(huán)，72℃10 min。β-actinmRNA反應(yīng)體系除引物不同以外，其余同CT-1 mRNA反應(yīng)體系;反應(yīng)參數(shù)為94℃ 5 min，94℃變性30 s，54℃退火45 s，72℃延伸45 s，28 循環(huán)，72℃ 10 min。取8 μl產(chǎn)物在含溴乙錠的1.2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，采用圖像掃描系統(tǒng)對(duì)各組PCR產(chǎn)物進(jìn)行光密度掃描。

1.5 主要試劑 卡托普利粉劑由常州制藥廠提供;Iso由美國(guó)Sigma公司提供;Trizol由Invitrogens公司提供;RT-PCR反應(yīng)試劑盒由Promega公司提供;引物由上海申能博彩生物科技有限公司提供，CT-1引物:上游為5'-GCGTCTTCTCAGCTAAGG-3'，下游為 5'-GAACACACATGGATGACATAG-3'，擴(kuò)增片段范圍200 bp;gp130引物:上游5'-CATCAACAGAACGGCATCCAG-3'，下游 5'-TCACTTTATCCACGGGGTCAA-3'，擴(kuò)增片段范圍416 bp;β-actin引物:上游為 5'-GCCCCTGAGGAGCACCCTGT-3'，下游為 5'-ACGCTCGGTCAGGATCTTCA-3'，擴(kuò)增片段范圍300 bp;Taq由寶生物工程(大連)有限公司提供;100 bp DNA Ladder由北京天為時(shí)代科技有限公司提供。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS12.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以±s表示，多個(gè)樣本之間用方差分析，兩組之間比較用q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織的病理變化 對(duì)照組大鼠心肌組織未見(jiàn)異常。Iso損傷組心肌組織呈不同程度壞死，為多發(fā)性灶狀和片狀壞死，壞死中心部心肌細(xì)胞崩解消失，并有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，壞死部位常累及左室游離壁和室間隔近心尖部以及乳頭肌和心內(nèi)膜下層心肌;Cap預(yù)處理組心肌細(xì)胞呈不同程度的空泡變性及顆粒變性，間質(zhì)水腫明顯，嚴(yán)重者可見(jiàn)小灶狀壞死，心肌壞死灶內(nèi)可見(jiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，病灶多分布于心內(nèi)膜下。Cap預(yù)處理組與Iso損傷組比較，心肌壞死面積占心肌總面積的百分比明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見(jiàn)圖1，表1。

2.2 大鼠血清心肌酶測(cè)定 與對(duì)照組比較，Iso損傷組血清CK、GOT、LDH均升高(P＜0.01);與 Iso損傷組比較，Cap預(yù)處理組 CK、GOT、LDH明顯降低(P ＜0.01，P ＜0.05)。

2.3 心肌CT-1 mRNA和gp130 mRNA表達(dá) 三組大鼠心肌組織均能擴(kuò)增出200 bp和416 bp的DNA條帶。與對(duì)照組比較，Iso損傷組CT-1 mRNA、gp130 mRNA表達(dá)增高(P＜0.01);與Iso損傷組比較，Cap預(yù)處理組CT-1 mRNA、gp130 mRNA表達(dá)明顯增高(P＜0.01，P＜0.05)。見(jiàn)圖2，表1。

表1 大鼠心肌壞死面積、血清心肌酶及心肌CT-1 mRNA、gp130 mRNA表達(dá)(±s，n=20)

表1 大鼠心肌壞死面積、血清心肌酶及心肌CT-1 mRNA、gp130 mRNA表達(dá)(±s，n=20)

與Iso損傷組比較:1)P＜0.01，2)P＜0.05;與對(duì)照組比較:3)P＜0.01

871±128 92±13 433±42 0.34±0.05 0.64±0.07 Iso損傷組 12.37±1.903) 3187±2563) 175±253) 632±953) 0.56±0.093) 0.75±0.093)Cap預(yù)處理組 5.45±0.901) 1628±1981) 133±231) 583±602) 0.71±0.181) 0.83±0.082)CT-1 mRNA gp130 mRNA對(duì)照組組別 心肌壞死面積(%) CK(U/L) GOT(U/L) LDH(U/L)0

圖1 各組大鼠心肌組織(HE，×66)

圖2 各組大鼠心肌組織CT-1 m RNA、gp130 m RNA、β-actin RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

3 討論

在心肌細(xì)胞，CT-1與其受體gp130結(jié)合后，誘導(dǎo)gp130二聚體形成，從而激活胞漿內(nèi)的酪氨酸激酶，轉(zhuǎn)導(dǎo)胞內(nèi)信號(hào)。CT-1通過(guò)兩條不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮不同的作用〔3〕，一條是通過(guò)Janus酪氨酸激酶/信號(hào)傳導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(JAK/STAT3)途徑介導(dǎo)心肌肥大;另一條是通過(guò)P42/P44絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)途徑介導(dǎo)心肌細(xì)胞保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明在使用異丙基腎上腺素致大鼠心肌損傷后，CT-1和gp130在轉(zhuǎn)錄水平呈反應(yīng)性升高。MAPK途徑是細(xì)胞外信號(hào)引起核反應(yīng)的細(xì)胞信息傳遞的共同通路，CT-1作為一種細(xì)胞因子可通過(guò)G蛋白或酪氨酸蛋白激酶的活化，激活Raf→MAPK激酶→MAPK磷酸化的連鎖反應(yīng)，經(jīng)過(guò)MAPK的核轉(zhuǎn)位，引起轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化，調(diào)節(jié)應(yīng)激性蛋白基因的表達(dá)，誘導(dǎo)熱休克蛋白 70(hsp70)和熱休克蛋白 90(hsp90)的合成〔4，5〕。hsp70是細(xì)胞保護(hù)性蛋白，能促進(jìn)新生多肽鏈的正確折疊，協(xié)助新生蛋白質(zhì)的合成和修復(fù)損傷的蛋白質(zhì)，維持蛋白質(zhì)合理構(gòu)象;并能激活某些酶的作用，以維護(hù)細(xì)胞的功能和生存。推測(cè)CT-1在異丙基腎上腺素致大鼠心肌損傷過(guò)程中升高，可能是對(duì)缺血性心肌損傷的適應(yīng)性反應(yīng)。

組織、器官經(jīng)過(guò)短時(shí)間，多次重復(fù)缺血，不僅不會(huì)發(fā)生累積性損傷，相反能減輕隨后的長(zhǎng)時(shí)間缺血引起的損傷，這種現(xiàn)象稱(chēng)之為缺血預(yù)適應(yīng)(IP)。根據(jù)IP的機(jī)制，可以有目的地模擬或影響IP的各環(huán)節(jié)，以藥物代替短暫缺血，能更有效地保護(hù)心臟，稱(chēng)之為藥理性預(yù)適應(yīng)。Cap是第一代ACEI，在臨床上廣泛使用，并被成功應(yīng)用于IP動(dòng)物模型的制備。在IP的保護(hù)作用研究中發(fā)現(xiàn)有hsp70的表達(dá)增加，且與IP的保護(hù)作用呈正相關(guān)，但hsp70表達(dá)上調(diào)的具體機(jī)制尚不明確〔6〕。本文說(shuō)明卡托普利預(yù)處理能減輕心肌損傷，并能促進(jìn)心肌損傷后CT-1及其受體gp130在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。推測(cè)在異丙基腎上腺素致大鼠心肌損傷過(guò)程中，Cap預(yù)處理可能是通過(guò)促進(jìn)CT-1的表達(dá)，激活MAPK通路，誘導(dǎo)hsp70合成增加。hsp70能夠穩(wěn)定、消除和修復(fù)細(xì)胞內(nèi)變性的蛋白質(zhì)，恢復(fù)細(xì)胞功能，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

Hattori等報(bào)道〔7〕，JAK/STAT信號(hào)通路也參與缺血預(yù)適應(yīng)誘發(fā)的早期心肌保護(hù)作用，缺血預(yù)適應(yīng)減輕了缺血再灌注引起的心功能障礙，改善了心肌收縮力，減少了心肌梗死面積和心肌細(xì)胞凋亡，這一系列的保護(hù)作用可被JAK抑制劑AG490消除，說(shuō)明缺血預(yù)適應(yīng)激活JAK/STAT3通路誘發(fā)心肌存活通路，發(fā)揮早期心肌保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)推測(cè)，Cap還可能是通過(guò)增加CT-1的表達(dá)，激活JAK/STAT3通路，來(lái)發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

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R34

A

1005-9202(2012)12-2554-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.12.050

1 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)克山病研究所

顧 明(1971-)，男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事缺血性心肌病的分子生物學(xué)研究。

〔2009-05-25收稿 2009-12-21修回〕

(編輯 袁左鳴)