付 軍 張 婧 黃慧琳 冷吉燕 (吉林大學白求恩第一醫(yī)院，吉林 長春 130021)

內皮型一氧化氮合酶基因導入對高血壓大鼠細胞凋亡的影響

付 軍 張 婧 黃慧琳 冷吉燕 (吉林大學白求恩第一醫(yī)院，吉林 長春 130021)

目的研究內皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因導入對高血壓大鼠心臟、腎臟細胞凋亡的影響。方法將實驗大鼠分為自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)組、AAV-LacZ組和AAV-eNOS組，每組8只，另設8只正常血壓(WKY)大鼠為WKY組。AAV-eNOS組經尾靜脈注射AAV-eNOS 200μl(含eNOS基因拷貝1×1012)，AAV-LacZ組注射AAV-LacZ 200μl，WKY及 SHR組大鼠分別經尾靜脈給予等量0.1 mol/L PBS。應用原位末端標記(TUNEL)法檢測各組大鼠心、腎組織中的細胞凋亡，免疫組織化學方法檢測eNOS的表達。結果①SHR組大鼠心肌組織及腎臟組織染色陽性信號明顯增多，與WKY組比較具有顯著性差異(P＜0.05)，AAV-eNOS組凋亡陽性信號明顯低于SHR組，差異顯著(P＜0.05)。②SHR組及AAV-LacZ組大鼠心肌組織eNOS表達低于WKY組，差異具有顯著性(P＜0.05);與SHR組大鼠比較，AAV-eNOS組eNOS表達明顯增加，差異具有顯著性(P＜0.05)。各組大鼠腎臟eNOS蛋白表達未見明顯差異。結論eNOS基因導入可明顯抑制心肌及腎臟組織細胞的凋亡，保護靶器官。

內皮型一氧化氮合酶;高血壓;細胞凋亡

高血壓心臟重塑的機制至今尚未完全闡明，有學者認為主要與心肌細胞機械應力增加和多種神經-體液因素及心血管組織旁分泌/自分泌因子的參與有關〔1〕。最近國外研究表明，高血壓主要靶器官(心、腦、腎)中均存在細胞凋亡現象，推測心肌細胞凋亡可能在高血壓心肌肥厚和心力衰竭發(fā)病中起重要作用〔2〕，為從全新的角度認識高血壓、心肌肥厚和心力衰竭的發(fā)病機制提供了新的思路。本研究通過導入內皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因，觀察其對高血壓大鼠心臟、腎臟細胞凋亡的影響，進一步探討eNOS基因保護靶器官的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 凋亡細胞原粒末端轉移酶標記法(TUNEL)檢測試劑盒，武漢博士德生物工程公司;人腺相關病毒(AAV)-eNOS轉染、鑒定、包裝、擴增、濃縮等過程均由美國佛羅里達大學王秀清教授完成。雄性自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)及正常血壓(WKY)大鼠由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證編號:SCXK(京)2002-0003。將大鼠置于動物實驗室，室溫控制在17℃ ～21℃，濕度50% ～70%，每日通風2～3次，每次1 h?？刂茣円构庹眨苊膺^多噪聲及其他干擾。大鼠分籠飼養(yǎng)(干籠，水沖式)，每籠4只。給予通用鼠料喂養(yǎng)，飲水采用自來水煮沸后的冷卻水，不限制進食量及飲水量。

1.2 方法

1.2.1 分組 分為SHR組、空載體對照組(AAV-LacZ組)和eNOS治療組(AAV-eNOS組)，每組8只，另設8只WKY大鼠為WKY組。AAV-eNOS組經尾靜脈注射AAV-eNOS 200μl(含 eNOS基因拷貝 1×1012)，AAV-LacZ組注射 AAV-LacZ 200μl，WKY組及 SHR組大鼠分別經尾靜脈給予等量0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)。

1.2.2 TUNEL法檢測各組大鼠心肌及腎臟組織細胞凋亡(1)操作步驟:常規(guī)制備的心肌、腎臟組織石蠟切片在37℃恒溫箱中烤片過夜，然后常規(guī)脫蠟，梯度酒精脫水。用蛋白酶 K(20μg/ml溶于 Tris-HCl中，pH7.4～8.0)室溫孵育 30 min。新鮮配制的3%H2O2溶液室溫避光浸泡30 min，封閉內源性過氧化物酶。PBS振蕩洗滌 2次，每次 5 min，滴加 50μl TUNEL反應混合溶液，陰性對照以不含Bio-dUTP的TDT反應液代替，在濕盒中37℃孵育60 min，PBS液振蕩洗滌3次。加入50μl轉化劑辣根過氧化物酶(POD)，在濕盒中37℃孵育30 min，PBS液振蕩洗滌3次，加入50～100μl二氨基聯苯胺(DAB)底物溶液，室溫孵育10 min，PBS液振蕩洗滌3次。蘇木素復染2 min，脫水、透明、封片、鏡檢。(2)結果定量分析:以細胞核內呈現棕黃色顆粒，且其著色強度高于背景非特異性染色者判定為陽性。凋亡陽性細胞核呈棕黃色，陰性細胞核呈藍色。在每張切片區(qū)隨機選取10個高倍鏡視野(×400)，用 Image-Pro-Plus圖像分析系統(tǒng)進行圖片處理，對所選視野內的陽性信號進行圖像分析，計算各組大鼠心肌、腎臟組織陽性信號的平均光密度。

1.2.3 免疫組化法檢測各組大鼠心肌及腎臟組織中 eNOS、AT1表達 采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法(SP)二步法進行免疫組織化學染色，以 PBS代替一抗作陰性對照。以細胞質內呈現棕黃色顆粒，且其著色強度高于背景非特異性染色者判定為陽性。在每張切片區(qū)隨機選取10個高倍鏡視野(×400)，用Image-Pro-Plus圖像分析系統(tǒng)進行圖片處理，對所選視野內的免疫組化陽性信號進行圖像分析，計算各組大鼠心肌、腎臟陽性信號的平均密度。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行分析，實驗數據用±s表示，采用單因素方差分析(ANVOA)，組間比較采用LSD法。

2 結果

2.1 TUNEL檢測結果 SHR組大鼠心肌組織及腎臟組織染色陽性信號明顯增多，與WKY組比較具有顯著性差異(P＜0.05)，AAV-eNOS治療組凋亡陽性信號明顯低于SHR組，差異顯著(P＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠心臟及腎臟組織TUNEL檢測結果(±s，n=8，%)

表1 各組大鼠心臟及腎臟組織TUNEL檢測結果(±s，n=8，%)

與WKY組比較:1)P＜0.05;與SHR組比較:2)P＜0.05;與AAVLacZ組比較:3)P＜0.05;下表同

18.3±2.2 16.7±1.9 SHR組 44.6±4.11) 54.6±5.41)AAV-LacZ組 43.5±5.11) 53.6±5.91)AAV-eNOS組 27.6±2.91)2)3) 29.8±3.91)2)3)組別 心臟 腎臟WKY組

2.2 eNOS免疫組化檢測結果 WKY組心肌細胞質中可見eNOS陽性表達信號，SHR組及AAV-LacZ組大鼠心肌組織eNOS表達低于WKY組，且差異有顯著性(P＜0.05);AAV-eNOS組eNOS表達明顯增加。各組大鼠腎臟eNOS蛋白表達未見明顯差異(P＞0.05)。見表2。

表2 各組大鼠心臟及腎臟組織eNOS及AT1免疫組化檢測結果(±s，n=8，%)

表2 各組大鼠心臟及腎臟組織eNOS及AT1免疫組化檢測結果(±s，n=8，%)

組別 心臟eNOS AT1 腎臟23.2±3.4 16.0±2.2 6.1±0.5 13.6±1.1 SHR組 17.6±1.71) 37.6±2.91) 5.6±0.7 27.6±2.71)AAV-LacZ組 17.8±1.61) 36.5±3.21) 5.5±0.7 27.5±2.21)AAV-eNOS組 47.2±4.11)2)3)27.5±3.61)2)3) 6.1±0.9 16.6±1.91)2)3)eNOS AT1 WKY組

3 討論

本研究應用TUNEL法檢測心肌細胞凋亡，發(fā)現SHR的心肌細胞凋亡率較WKY大鼠明顯升高，說明心肌細胞凋亡是高血壓靶器官損害的表現之一;用AAV-eNOS靜脈注射4 w后，治療組大鼠心肌細胞凋亡率明顯降低，表明AAV-eNOS可抑制心肌細胞凋亡，從而實現抑制心肌纖維化、保護心肌功能的作用，但其具體機制尚需進一步研究。心肌細胞凋亡在SHR心臟重塑方面起重要作用，心肌細胞凋亡減少可能與左心室高壓(LVH)有關，而心肌細胞凋亡增多可能與慢性心力衰竭(CHF)有關，在SHR高血壓→LVH→心力衰竭演進過程中其心肌細胞增生與凋亡的程度不同，可能存在明顯的心肌細胞增生與凋亡的時間窗。心肌細胞增生為主的時間窗可能為SHR出生后至1個月以內和5～17個月之間，而心肌細胞凋亡為主的時間窗可能為1～4個月之間和18個月以后。SHR早期發(fā)生LVH之前出現短暫心肌細胞凋亡增多的機制目前尚不清楚，推測可能與心臟對心肌細胞增生過度的代償性反應(即代償性心肌細胞凋亡增多)有關〔3～5〕。此時的心肌細胞凋亡增多可能是繼發(fā)性的心肌細胞凋亡增多。當代償性心肌細胞凋亡無法對抗SHR的心肌細胞增生時，心臟的適應性反應就會發(fā)生逆轉而進入心肌細胞增生、肥大和原發(fā)性心肌細胞凋亡不足，出現LVH。SHR長期慢性壓力超負荷時心肌細胞凋亡再次被觸發(fā)，造成過度代償肥厚的心臟心肌細胞逐漸丟失，最終導致心力衰竭的機制目前仍未完全闡明。

眾所周知，腎臟也是原發(fā)性高血壓繼發(fā)性損害的一個重要靶器官之一。目前認為，細胞凋亡在高血壓腎臟損害中既有保護作用又有損傷和致病作用。Aizawa等〔6〕研究發(fā)現大鼠連續(xù)注射血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)7 d后，腎臟組織中細胞凋亡數目明顯增加，且凋亡細胞主要集中在腎小管間質部。Moreau等〔4〕研究新生SHR心臟和腎臟增生和凋亡情況表明，新生SHR與正常血壓大鼠相比，前者心臟和腎臟細胞凋亡明顯減少，而增生指數分析結果顯示，前者心臟和腎臟增生明顯增加。由此得出結論，細胞凋亡減少會導致(至少部分導致)新生SHR心臟和腎臟增生。本研究發(fā)現，SHR組大鼠腎臟組織中可見大量細胞凋亡，尤以腎小球系膜細胞為重，但間質也可見廣泛細胞凋亡，說明細胞凋亡也是SHR繼發(fā)腎損害的機制之一。應用AAV-eNOS治療4 w后，治療組大鼠腎組織細胞凋亡率明顯降低，表明AAV-eNOS治療有保護原發(fā)性高血壓腎臟損害的作用，但其具體機制尚不清楚。

1 龍超良，汪 海，肖文彬.高血壓心血管重構及其藥物治療〔J〕.軍事醫(yī)學科學院院刊，1997;21(1):63-7.

2 Hamet P，Richard L，Dam TV，et al.Apoptosis in target organs of hypertension〔J〕.Hypertension，1995;26(4):642-8.

3 Li Z，Bing OH，Long X，et al.Increased cardiomyocyte apoptosis during the transition to heart failure in the spontaneously hypertensive rat〔J〕.Am JPhysiol，1997;272(5-2):2313-9.

4 Moreau P，Tea BS，Dam TV，et al.Altered balance between cell replication and apoptosis in hearts and kidneys of newborn SHR〔J〕.Hypertension，1997;30(3-):720-4.

5 Hamet P，Moreau P，Dam TV，et al.The time window of apoptosis:a new component in the therapeutic strategy for cardiovascular remodeling〔J〕.J Hypertens Suppl，1996;14(5):65-70.

6 Aizawa T，Ishizaka N，Kurokawa K，et al.Different effects of angiotensinⅡand catecholamine on renal cell apoptosis and proliferation in rats〔J〕.Kidney Int，2001;59(2):645-53.

R544.1

A

1005-9202(2012)12-2537-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.12.043

吉林省科學技術廳資助項目(No.200505199)

冷吉燕(1965-)，女，博士，教授，碩士生導師，主要從事老年病學研究。

付 軍(1959-)，男，博士，教授，碩士生導師，主要從事老年病學研究。

〔2011-12-29收稿 2012-01-20修回〕

(編輯 袁左鳴)