董賢慧 錢 濤 高維娟 賀小平 侯淑敏 韋素春 楊國興

(承德醫(yī)學院脊髓損傷與修復研究，河北 承德 067000)

兔眼真菌性角膜炎模型的病理學觀察

董賢慧 錢 濤 高維娟 賀小平 侯淑敏 韋素春 楊國興

(承德醫(yī)學院脊髓損傷與修復研究，河北 承德 067000)

目的觀察兔眼真菌性角膜炎(FK)動物模型的病理學改變。方法新西蘭白兔15只(30只眼)，隨機分為模型組、生理鹽水組和正常對照組，每組10只兔眼。采用角膜基質注射法建立茄病鐮刀菌性角膜炎模型，接種后2 d角膜刮片行真菌培養(yǎng);接種后1、2、6、8、14、20 d和30 d，對兔眼潰瘍評分;接種后3、8、15、30 d于裂隙燈下觀察兔眼病理變化并拍照;接種后30 d處死家兔，取角膜，HE染色，光鏡下觀察組織病理學改變，PAS染色觀察角膜基質層間的真菌菌絲，電鏡觀察角膜超微結構改變。結果模型組角膜刮片真菌培養(yǎng)均可見典型真菌菌落生長;與正常對照組相比，模型組在接種1、2、6、8、14、20 d和30 d后，角膜潰瘍評分均有顯著性差異(P＜0.05)。模型組接種3、8、15、30 d后，分別可見角膜潰瘍、穿孔、前房積膿、新生血管、角膜白斑等并發(fā)癥。HE染色、PAS染色、電鏡觀察均顯示模型組角膜感染樣改變。生理鹽水組和正常對照組未見明顯病理改變。結論角膜基質注射法可以成功建立兔眼的真菌性角膜炎模型，出現(xiàn)典型的形態(tài)學改變。

真菌性角膜炎;茄病鐮刀菌;病理觀察

由于真菌性角膜炎(FK)發(fā)病機制尚不清楚且缺乏有效藥物，所以治療棘手，預后差，可引起嚴重的角膜潰瘍，常導致角膜穿孔、眼內炎，甚至角膜盲以及眼球喪失等，因此FK目前仍是眼科醫(yī)師乃至全世界眼科領域所面臨的一大難題。近年來FK發(fā)病率在我國明顯升高〔1〕，已成為角膜盲的首要病因，因此，認識該病病理過程和特點，是對其進行有效治療的前提和關鍵。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 新西蘭白兔15只，體重(1.6±0.5)kg，雌雄兼用，健康無眼疾，由河北省實驗動物中心提供，合格證號:1005202。購進后進行2 w預飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件:(20～29)℃，相對濕度(40～60)%RH。

1.2 茄病鐮刀菌菌液的制備 茄病鐮刀菌(由中科院微生物研究所提供，編號為3.5840)。將茄病鐮刀菌菌種(真空保存孢子粉)溶于生理鹽水，轉接在新鮮的PDA(Oxoid，產自Basing-stoke，Hampshire，UK)斜面上。為誘導茄病鐮刀菌形成大量孢子而非菌絲，先將其35℃溫箱孵育2 d，再25℃溫箱孵育至7 d〔2〕，選擇生長良好的菌落連續(xù)轉接2次培養(yǎng)。取含有0.1%吐溫80的無菌鹽水1 m l，涂滿整個菌落，用吸液管尖端輕輕地刺破菌落并與鹽水混勻得到菌懸液，接著把含孢子和菌絲的混懸液移入無菌試管，待5 min重顆粒沉淀下來后把上層均一化的懸浮液轉入另一無菌試管，蓋緊蓋子置于渦流器15 s使懸浮液充分混勻，梯度稀釋，在顯微鏡下用血細胞計數(shù)板計數(shù)，調整濃度至1.5×106CFU/m l作為接種液濃度。

1.3 實驗分組和模型制備 隨機數(shù)字表法將30只兔眼分為3組:模型組，生理鹽水組和正常對照組，每組10只兔眼。健康兔眼預防性應用妥布霉素滴眼液3d后，用速眠新1 m l/kg肌肉注射麻醉。接種眼用1/1 000的升汞和生理鹽水沖洗2次，0.06%的碘伏消毒;鋪巾;鹽酸丙美卡因滴眼液表面麻醉2次。用開瞼器開瞼，固定上直肌，模型組用角膜基質注射針角膜基質層間注射10μl含標準茄病鐮刀菌菌株的混懸液，生理鹽水組注射10μl生理鹽水，正常對照組不作任何處理。在接種的同時各組分別于結膜下注射10μl糖皮質激素。術后接種眼涂妥布霉素眼藥膏。

1.4 動物模型建立成功的判斷標準 ①形成典型的角膜潰瘍灶;②3次角膜組織真菌培養(yǎng)中至少1次為陽性，有與接種菌同種菌落發(fā)育;滿足以上兩者即確定為接種成功。

1.5 檢測指標 接種后2 d角膜刮片行真菌培養(yǎng)，KOH涂片檢查及吉姆薩染色觀察致病菌形態(tài)，以明確模型建立情況;接種后 1、2、6、8、14、20 d 和 30 d，按照潰瘍評級評分標準(表 1)對實驗兔眼的感染情況進行評分;接種后3、8、15、30 d于裂隙燈下觀察其病理變化，30 d耳緣靜脈空氣栓塞處死家兔，取角膜，HE染色，光鏡下觀察組織病理學改變;PAS染色觀察角膜基質層間的真菌菌絲;電鏡觀察角膜超微結構改變。

表1 潰瘍評級評分標準

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0軟件包進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，各組間不同檢查時間點的臨床評分比較采用重復測量資料的多因素方差分析。

2 結果

2.1 兔眼FK模型建立情況 模型組10只兔眼，全部發(fā)病，接種后2 d角膜刮片真菌培養(yǎng)可見典型茄病鐮刀菌菌落，生長較快，呈棉花狀，初期為白色最后可呈粉紅色(圖1)，刮片菌絲發(fā)現(xiàn)率為100%。吉姆薩染色可見:茄病鐮刀菌菌絲成90°出芽生長(圖1)，分生孢子有14個隔，其大分生孢子較粗壯，小分生孢子多呈假頭狀排列，產孢細胞較長。KOH涂片可見:成熟孢子的形狀呈典型的鐮刀形或新月形(圖1)，為茄病鐮刀菌感染，未發(fā)現(xiàn)細菌感染。按照動物模型建立成功的判斷標準，確認模型建立成功。生理鹽水組和正常對照組兔眼未見明顯的角膜炎癥表現(xiàn)，角膜刮片真菌培養(yǎng)未見菌落形成。

圖1 兔眼FK角膜刮片

2.2 角膜接種后病理變化 生理鹽水組和正常對照組兔眼在3、8、15、30 d 均可見角膜透明、虹膜結膜無充血腫脹(圖 2a，2b，2c，2d)。模型組接種3 d可見角膜全層水腫，潰瘍形成，干燥致密，粗糙不平，局部隆起有典型菌落生長(圖2e)。接種8 d，潰瘍面積進一步擴大，感染達到最高峰，角膜緣有新生血管長入(圖2f)。接種15 d，潰瘍面積不再擴大，顯示出逐漸縮小的趨勢，周圍被大量新生血管包繞(圖2g)。接種30 d，角膜白斑形成(圖2h)，白斑周圍無浸潤，邊界清楚，角膜周邊有新生血管(圖2i)。

圖2 角膜接種后病理變化

2.3 角膜潰瘍評分結果 模型組在接種后1 d、2 d、6 d、8 d、14 d、20 d、30 d角膜潰瘍評分為別為:1.136 ±0.149，1.364 ±0.124，3.023 ±0.211，3.586 ±0.211，3.818 ±0.165，3.614 ±0.285，2.866±0.467。正常對照組和生理鹽水組各個時間點角膜潰瘍評分均為0分。與正常對照組相比，模型組在各個時間點角膜潰瘍評分均有顯著性差異(P＜0.05)，生理鹽水組各個時間點評分均無改變(P＞0.05)。

2.4 HE染色觀察角膜病理形態(tài)學變化 正常對照組和生理鹽水組兔眼角膜HE染色可見:角膜基質細胞排列整齊，未見中性粒細胞浸潤。模型組潰瘍處角膜上皮淺基質層缺損，潰瘍周邊角膜上皮腫脹，角膜基質纖維排列紊亂，角膜基質層可見少量中性粒細胞，潰瘍部位角膜上皮及淺基質修復，基質內較多成纖維細胞，細胞走形與基質纖維平行，基質內可見較多新生血管。見圖3。

2.5 PAS染色觀察結果 正常對照組和生理鹽水組兔眼角膜PAS染色未見有菌絲。模型組PAS染色顯示:真菌菌絲于角膜基質層內呈平行生長。見圖4。

2.6 透射電鏡觀察家角膜超微結構改變 正常對照組和生理鹽水組兔眼角膜透射電鏡觀察可見角膜細胞周圍有大量的膠原原纖維，結構完整，排列整齊。模型組顯示角膜前上皮增生，分層，大空泡形成。見圖5。

圖3 角膜病理學變化(HE)

圖4 角膜PAS染色

圖5 角膜透射電鏡觀察

3 討論

在選擇動物做模型時應該考慮動物的可用性及是否需要特殊種類的動物、適用性(包括飼養(yǎng)費，飼養(yǎng)難易程度等)以及動物的數(shù)量。FK發(fā)生于馬、狗、爬行動物等均較少見。雖然目前有關于馬的臨床表現(xiàn)、愈合模式、危險因素及預后的報道〔3〕，但常見真菌研究中使用的動物多為小動物。小鼠和豚鼠能滿足絕大多數(shù)真菌接種的需要，小鼠是真菌病動物模型中最常用的一種動物，但小鼠的角膜很小，進行手術操作時困難，感染后可取材的標本少，而且不利于真菌感染大體形態(tài)學的觀察。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，新西蘭白兔作為真菌性角膜炎模型的實驗動物，角膜較大，且兔眼茄病鐮刀菌性角膜炎有自愈趨勢，其自然轉歸與人眼有一定差異。

選擇臨床常見的菌種，以便研究結果能應用于臨床，為保證實驗結果的可重復性和可靠性，盡可能選用權威微生物種保存機構保存的標準菌株，最佳者為分離自臨床真菌性角膜炎患者的標本。目前所報道的與人類FK相關的致病菌有70余種〔4〕，常見的、主要致病菌屬為鐮刀菌屬、曲霉菌屬、青霉菌屬、枝頂孢霉屬、念珠菌屬和暗色孢科真菌。我國是FK的高發(fā)區(qū)，外傷感染仍是目前最常見的原因，主要是絲狀真菌感染，超過70%的分離菌株為茄病鐮孢菌和煙曲霉菌。綜合一些印度〔5〕、美國南部〔6〕和我國〔7，8〕的研究報道，鐮刀菌是引起真菌性角膜炎最常見的真菌菌屬，而鐮刀菌屬中最主要的致病菌種是茄病鐮刀菌。茄病鐮刀菌，也叫腐皮鐮孢菌，是土壤中常見的腐生菌，是一種條件致病真菌，是最為常見的引起人類感染的鐮刀菌，它屬于鐮刀菌屬、半知菌亞門、絲孢菌綱、絲孢菌目、瘤座孢科，是廣泛存在于土壤、植物、空氣中的一種透明孢子絲菌〔9〕。因此，本實驗選擇茄病鐮刀菌標準菌株作為接種菌。

目前常用的真菌性角膜炎動物模型制作方法包括角膜接觸鏡法、針刺法、感染角膜植片法、角膜劃痕法、仿準分子激光角膜上皮磨鑲術(LASEK)法〔10～12〕等。本研究選擇兔眼角膜基質注射法作為探討茄病鐮刀菌性角膜炎的組織病理學特征的動物模型，有以下幾個原因:①兔是最常用與觀察真菌性角膜炎病理生理過程的動物模型，不受資源的限制;②基質注射法可相對準確地控制茄病鐮刀菌孢子接種的量和角膜接種深度;③兔眼角膜潰瘍容易觀測，對抗真菌藥物的治療評價已經有一些比較成熟的指標可供借鑒。

FK的發(fā)生被公認為與真菌毒力因素和宿主免疫防御因素間相互作用的動態(tài)平衡被破壞有關。健康人結膜囊有真菌寄生，帶菌率5%～83%不等。真菌寄生于健康人結膜囊而不致病，能與宿主維持共生現(xiàn)象，顯示正常眼結膜及角膜對寄生真菌有足夠的免疫力;事實上，健康人結膜囊內需氧菌、少量厭氧菌和某些真菌維持平衡生長，近年來眼科臨床角膜真菌感染病例明顯增多，被認為與抗生素及皮質類固醇激素廣泛應用有關。眼部真菌感染很少是原發(fā)的，機體的狀態(tài)和外在因素均不同程度的影響著感染的發(fā)生、發(fā)展。正常菌群與人體間的平衡一旦被打破，原來在正常情況下不致病的寄生真菌就可能成為致病性真菌而引起眼疾，同時并不排除外來真菌的侵入而引發(fā)角膜感染。而FK發(fā)病機理的研究至今沒有確切的結論，也限制著臨床FK防治研究的發(fā)展。

本研究在成功建立FK兔眼模型的基礎上，進行了致病真菌菌絲及孢子的生長特點的觀察，為臨床上明確FK的致病菌種提供依據(jù)，從而進一步決定治療方案。臨床上早期明確診斷以及合理的治療是提高該病患者生活質量的有效手段。目前用于明確FK的診斷方法有:角膜刮片、涂片檢查、真菌培養(yǎng)、共焦顯微鏡檢查、病理學檢查、聚合酶鏈反應、基因芯片技術、熒光顯微鏡檢測法和免疫學方法等。但能夠應用于早期明確診斷的技術依然十分有限，各種檢查方法都各有利弊。很多新技術尚處于研究階段，其可靠性及穩(wěn)定性仍需要進一步考證。臨床上確診FK依然依賴于實驗室診斷，角膜刮片染色鏡檢依然是臨床決策中的首選方法。目前還沒有一種診斷技術能夠完全達到臨床診斷的需求。希望廣大眼科工作者能在臨床診斷FK方面有更多突破，以尋找一套確實可行又非常有效的明確臨床角膜真菌感染的診斷方案。

致病真菌生長方式可以決定FK的治療方案，茄病鐮刀菌在兔角膜內呈平行生長，這種模式真菌侵犯角膜在垂直方向上感染程度輕，早期不易穿透至前房，但它會向水平方向擴散。所以此類角膜感染早期可以考慮藥物治療為主，選取敏感的抗真菌藥物，局部聯(lián)合全身應用，或及時選擇板層移植手術而非穿透性角膜移植手術。本研究對兔眼FK模型進行了病理學觀察，發(fā)現(xiàn)在兔角膜內，茄病鐮刀菌菌絲呈平行生長，菌絲局限于淺層角膜板層結構間，因此，可為臨床上針對茄病鐮刀菌引起的FK選擇最佳的治療方法和手術時機提供重要的理論參考依據(jù)。實驗還發(fā)現(xiàn)茄病鐮刀菌性角膜炎早期表現(xiàn)為角膜浸潤水腫，角膜基質中均勻分布炎性細胞，多數(shù)位于角膜前2/3，中性粒細胞為主，感染高峰時病灶也局限于角膜淺層，早期可見反應性的前房滲出，觀察期間角膜感染情況發(fā)展緩慢，且隨著病程延長感染灶有收縮局限的趨勢，前房積膿消退。為清楚人類FK的病理過程，以及后期FK發(fā)病機制、診斷治療的發(fā)展進行了補充，并為進一步研究高效、廣譜、低毒的抗真菌藥物奠定了基礎。

1 Sun XG，Zhang Y，Li R，et al.Etiological analysis on ocular fungal infectionin the period of 1989-2000〔J〕.Chin Med J(Engl)，2004;117(4):598-600.

2 董賢慧，錢 濤，高維娟，等.茄病鐮刀菌生物學特性及溫度對其生長情況的影響〔J〕.中國真菌學雜志，2011;6(1):22-5.

3 Gaarder JE，Rebhun WC，Ball MA，et al.Clinical appearances，healing patterns，risk factors，and outcomes of horses with fungal keratitis:53 cases(1978-1996)〔J〕.JAm Vet Med Assoc，1998;213(1):105-12.

4 Tanure MA，Cohen EJ，Sudesh S，et al.Spectrum of fungal keratitis at Wills Eye Hospital，Philadelphia，Pennsylvania〔J〕.Cornea，2000;19(3):307-12.

5 Chowdhary A，Singh K.Spectrum of fungal keratitis in north India〔J〕.Cornea，2005;24(1):8-15.

6 Liesegang TJ，F(xiàn)orster RK.Spectrum ofmicrobial keratitis in South Florida〔J〕.Am JOphthalmol，1980;90(1):38-47.

7 Xie L，Zhong W，ShiW，et al.Spectrum of fungal keratitis in North China〔J〕.Ophthalmology，2006;113(11):1943-8.

8 Qiu WY，Yao YF，Zhu YF，et al.Fungal spectrum indentified by a new slide culture and in vitro drug susceptibility using Etest in fungal keratitis〔J〕.Curr Eye Ras，2005;30:1113-20.

9 Mayayo E，Pujol I，Guarro J.Experimental pathogenicity of four opportunist Fusarium species in a murine model〔J〕.JMed Microbiol，1999;48(4):363-6.

10 Wu TG，Wilhelmus KR，Mitchell BM.Experimental keratomycosis in a mousemodel〔J〕.Invest Ophthalmol Vis Sci，2003;44(1):210-6.

11 杜 蕊，吳 潔，馬吉獻，等.兔曲霉菌性角膜炎動物模型建立及角膜共焦顯微鏡檢查〔J〕.第四軍醫(yī)大學學報，2006;27(21):1925-8.

12 梁 濤，趙桂秋，劉蓬蓬，等.仿LASEK法建立煙曲霉菌角膜炎動物模型的研究〔J〕.眼科研究，2008;26(9):641-4.

Establishment and pathological observation of rabbitmodel w ith fungal keratitis

DONG Xian-Hui，QIAN Tao，GAO W ei-Juan，et al.
Department of Pathophysiology，Chengde M edical College，Chengde 067000，Hebei，China

ObjectiveTo observe the histopathological changes of animalmodelswith fungal keratitis.Methods15 New Zealand white rabbits(30 eyes)were divided into 3 groups，fungal keratitismodel，saline and control groups.Fusarium Solaniwas injected into the corneal stroma of the eyes to establish fungal keratitis.Saline was injected into the corneal stroma of the eyes of saline group.Noting was done in the control group.Lesion of cornea was taken and cultured after inoculated fungus for 2 days.The eyes of each group were examined clinically and respectively by slit lamp with a scoring system on day 1，2，6，8，14，20 and day 30.Photograph through the slit lamp on day 3，8，15 and day 30 after the inoculation.The rabbitswere sacrificed with ear vein of air embolism at30 day to observe the histological changes through HE，PASand electronmicroscope.ResultsAfter inoculating fungus for2 days，pathological staining showed that scattered fungal spores and hyphae were at corneal epithelium，and hyphae grew into corneal stroma.After inoculating fungus for3，8，15 and 30 days，there were corneal edema，ulceration，dryness and tightness，rough，uneven and swelling.HE，PAS stain and electron microscope showed that therewas corneal inflammation inmodel group.Therewas no obvious pathologic change in saline and control groups.ConclusionsFusarium Solani injection into the corneal of the eyes can be used to establish animalmodelswith fungal keratitis successfully with typical histopathological changes.

Fungal keratitis;Fusarium Solani;Pathological observation

R772.21;R363.2+1

A

1005-9202(2012)12-2527-04;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.12.040

國家科技支撐計劃重大項目(No.2007BAI26B07)

高維娟(1966-)，女，教授，博士，主要從事納他霉素治療真菌性角膜炎藥理學研究。

董賢慧(1983-)，女，助教，碩士，主要從事納他霉素治療真菌性角膜炎藥理學研究。

〔2011-10-18收稿 2011-12-12修回〕

(編輯 曹夢園)