閆鐵夫 (遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000)

黃芪注射液聯(lián)合阿維A治療銀屑病的療效

閆鐵夫 (遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000)

目的觀察黃芪注射液聯(lián)合阿維A治療老年銀屑病的臨床效果，及對角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和凋亡的影響。方法回顧性分析2009年9月至2010年12月經(jīng)病理活檢確診銀屑病的老年患者225例，分別觀察黃芪注射液聯(lián)合阿維A和阿維A治療銀屑病的療效。采用MTT法分析黃芪注射液聯(lián)合阿維A和阿維A對HaCaT細(xì)胞增殖的抑制作用。采用流式細(xì)胞儀分析黃芪注射液聯(lián)合阿維A和阿維A對HaCaT細(xì)胞周期和凋亡的影響。結(jié)果聯(lián)合治療組治愈135例、顯效24例、有效18例、無效6例，有效率96.72%，治愈率73.77%，療效顯著高于單獨治療組(P＜0.05)。在用藥濃度為125 mg/ml以下時，聯(lián)合藥物和單獨藥物的抑制作用具有劑量依賴性，且抑制率隨著藥物濃度增加而增加，且聯(lián)合藥物抑制率較單獨藥物高?；旌纤幬颕C50=68.3 mg/ml，單獨藥物IC50=128.5 mg/ml。聯(lián)合藥物抑制HaCaT細(xì)胞增殖的效果顯著高于單獨藥物(P＜0.05)。250mg/ml黃芪注射液和250mg/ml阿維A混合液作用后的HaCaT細(xì)胞凋亡峰明顯高于250mg/ml黃芪注射液單獨作用后的細(xì)胞。結(jié)論黃芪注射液聯(lián)合阿維A對銀屑病的治療效果顯著，并強(qiáng)于黃芪注射液。

黃芪注射液;阿維A;銀屑病;細(xì)胞周期

銀屑病是一種免疫異常(免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子和相關(guān)免疫因子紊亂)造成的皮膚角質(zhì)化細(xì)胞增殖過快、分化紊亂和皮膚角質(zhì)層的炎癥反應(yīng)〔1，2〕。目前，銀屑病的病因尚不明確，但從免疫系統(tǒng)角度篩選銀屑病的治療方法是一條可行研究思路〔3～7〕。本文主要探討治療老年銀屑病患者的方法，且從細(xì)胞水平研究治療藥物對角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT)增殖和凋亡的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 225例銀屑病患者均來自我院2009年9月至2010年12月皮膚科接收的病理活檢確診病例，按照治療方案分為聯(lián)合治療組和單獨治療組。聯(lián)合治療組183例，男92例，女91例，年齡62～70〔平均(66.2±2.6)〕歲，平均患病病程為(12.3±2.3)年，均接受黃芪注射液聯(lián)合阿維A治療;單獨治療組42例，男21例，女21例，年齡61～72〔平均(65.9±3.1)〕歲，平均患病病程為(11.9±2.5)年，均接受黃芪注射液治療。兩組患者在平均年齡、性別比和患病病程方面均無顯著差異，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 臨床治療方法和評價

1.2.1.1 聯(lián)合治療組方案 所有患者均在每日上午9:00～10:00靜脈注射黃芪注射液(黑龍江省珍寶島制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字號 Z23020782，10 m l/支)，每日50 m l與生理鹽水混合后靜脈滴注。同時予阿維A膠囊口服(Roche Products Ltd，10 mg/粒)，1 粒/次，總療程為 3 個月。

1.2.1.2 單獨治療組方案 患者僅單獨靜脈注射黃芪注射液，用法、用量同聯(lián)合治療組?？偗煶虨?個月。

1.2.2 評價方法 按照皮膚的損傷面積評價治療效果，分別統(tǒng)計頭面、上肢、軀干和下肢四個部分損傷面積百分比。無損傷計分為0，損傷1% ～9%計分為1，損傷10% ～29%計分為2，損傷30% ～49%計分為3，損傷50% ～69%計分為4，損傷70% ～89%計分為5，損傷大于90%以上計分為6。然后按照加權(quán)系數(shù)(頭面為0.1，上肢為0.2，軀干為0.3和下肢為0.4)計算總分?？傇u分=頭面計分×0.1+上肢計分×0.2+軀干計分×0.3+下肢計分×0.4，然后按照療效指數(shù)〔(治療前總評分－治療后總評分)×100%〕計算每個患者治療指數(shù)。療效指數(shù)＞90%為痊愈，60% ＜療效指數(shù)＜89%為顯效，20% ＜療效指數(shù)＜59%為有效，療效指數(shù)＜20%為無效。最終統(tǒng)計每組的痊愈、顯效、有效和無效例數(shù)，并且按照痊愈率=痊愈例數(shù)/總例數(shù)×100% 和有效率=(痊愈例數(shù)+顯效例數(shù)+有效例數(shù))/總例數(shù)×100% 計算出痊愈率和有效率。

1.2.3 細(xì)胞和主要試劑 HaCaT細(xì)胞購于美國ATCC，DMEM培養(yǎng)液購自美國Gibco公司;小牛血清(FBS)、四甲基耦氮唑藍(lán)(MTT)購于國藥化學(xué)試劑有限公司;胰蛋白酶購自上海第一生化藥業(yè)有限公司;二甲基亞砜(DMSO)購自武漢同興生物技術(shù)有限公司;其他試劑均購于國藥化學(xué)試劑有限公司。

1.2.4 MTT法檢測藥物對HaCaT細(xì)胞增殖的抑制作用 首先活化液氮儲存的HaCaT細(xì)胞，然后按照107/ml的劑量轉(zhuǎn)接到DMEM培養(yǎng)液中(含 10%FBS，100 U/ml青鏈霉素，pH7.2)，在37℃和5%CO2條件培養(yǎng)，再轉(zhuǎn)接傳代一次后;取對數(shù)生長期的細(xì)胞(定量為104/m l)進(jìn)行以下步驟的實驗。按照說明書使用DMEM稀釋黃芪注射液和溶解阿維A，黃芪和阿維 A 濃度分別為 4、8、16、31、62、125、250、500 mg/ml。同時用DMEM 稀釋黃芪注射液，濃度分別為 4、8、16、31、62、125、250、500 mg/ml。取對數(shù)生長期的細(xì)胞于96孔板中培養(yǎng)24 h后棄上清培養(yǎng)液，然后按照實驗設(shè)計分別加入100μl不同濃度的黃芪注射液和溶解阿維A的混合液和阿維A液，培養(yǎng)48 h后棄上清，再加入100μl DMEM培養(yǎng)液，再加入10μl 5 mg/ml的MTT，然后37℃再溫育4 h后加入100μl DMSO，震蕩后在570 nm處讀取讀數(shù)。同時設(shè)置空白孔和DMEM(不含藥物)孔。按照抑制率=1－(實驗孔－空白孔)/(DMEM孔－空白孔)，最終按照lgIC50=Xm－I〔P－(3－Pm －Pn)/4〕計算 IC50值，其中Xm:lg最大藥物作用濃度，I:lg(最大濃度/相鄰濃度)，P:陽性抑制率之和，Pm:最大陽性抑制率，Pn:最小陽性抑制率。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和凋亡 選取250 mg/m l黃芪注射液和溶解阿維A的混合液和黃芪注射液作用48 h時的HaCaT細(xì)胞作為研究細(xì)胞，以DMEM液培養(yǎng)的細(xì)胞作為陰性對照組。作用后的細(xì)胞消化后經(jīng)200 r/min離心5 min，再用冷磷酸鹽緩沖液 (PBS)清洗2次，再用70%乙醇重懸成單細(xì)胞固定，RNA酶37℃消化0.5 h后，用800μl碘化丙啶(PI)染色液避光4℃染色0.5 h。再用488 nm熒光的流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞，若在G1前出現(xiàn)亞二倍體峰則為凋亡，觀察凋亡峰。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)資料以±s表示，組間兩兩比較或者多樣本的計數(shù)資料分析采用χ2檢驗，多樣本之間的計數(shù)資料采用t檢驗或者方差分析。

2 結(jié)果

2.1 聯(lián)合治療組和單獨治療組治療效果 聯(lián)合治療組治愈135例、顯效24例、有效18例、無效6例，有效率96.72%，治愈率73.77%;單獨治療組治愈19例、顯效8例、有效4例、無效11例，有效率73.81%，治愈率45.24%。聯(lián)合治療組有效率和治愈率顯著高于單獨治療組(均P＜0.05)。

2.2 兩組藥物對HaCaT細(xì)胞的增殖抑制作用 在用藥濃度為125 mg/m l以下時，聯(lián)合治療組和單獨治療組的抑制作用具有劑量依賴性，且抑制率隨著藥物濃度增加而增加，且聯(lián)合治療組抑制率較單獨治療組高。聯(lián)合治療組IC50=68.3 mg/ml，單獨治療組IC50=128.5 mg/m l。通過IC50可知，聯(lián)合治療組抑制HaCaT細(xì)胞增殖的效果顯著高于單獨治療組(P＜0.05)。見表1。

表1 兩組藥物對HaCaT細(xì)胞增殖的抑制率比較(±s，%)

濃度(mg/ml)聯(lián)合治療組 單獨治療組0.94±0.03 0.83 ±0.02 8 2.53 ±0.12 2.43 ±0.13 16 15.38 ±0.28 8.24 ±0.27 31 38.13 ±2.37 21.28 ±2.19 62 57.15 ±2.37 32.31 ±1.93 125 68.26 ±5.28 47.23 ±4.03 250 71.38 ±4.38 48.72 ±3.98 4 500 71.28 ±3.25 49.25 ±2.99

2.3 兩組藥物對HaCaT細(xì)胞的凋亡作用 250 mg/m l黃芪注射液和250 mg/ml阿維A混合液與250 mg/ml黃芪注射液分別作用于HaCaT細(xì)胞48 h后，流失細(xì)胞儀主要檢測G1前出現(xiàn)亞二倍體峰(凋亡峰)。從凋亡峰可知，聯(lián)合治療組對HaCaT細(xì)胞的凋亡作用顯著高于單獨治療組，且細(xì)胞明顯停留在G1時期。見圖1。

圖1 兩組藥物作用于HaCaT細(xì)胞48 h后對細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

維A酸類藥物具有抑制細(xì)胞增殖、分化和抗炎癥作用，其中芳香維A酸乙酯作為第三代藥物已經(jīng)被證明極低劑量即可達(dá)到較好的治療效果〔8〕。本論文從臨床治療效果、細(xì)胞增殖和凋亡等方面評價黃芪注射液聯(lián)合阿維A的聯(lián)合治療效果，結(jié)果顯示黃芪注射液聯(lián)合阿維A對銀屑病的治療效果顯著。

選擇HaCaT作為增殖和凋亡研究的模型，是因銀屑病主要以角質(zhì)層細(xì)胞過度增殖和分化異常為主要特點，而HaCaT細(xì)胞是從人表皮角質(zhì)化分離的一種永生化的細(xì)胞，該細(xì)胞在銀屑病治療研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。對于該細(xì)胞的增殖和凋亡特點比較明了，在此基礎(chǔ)上設(shè)計實驗，本文結(jié)果表明，在用藥濃度為125 mg/m l以下時，混合藥物和單獨藥物的抑制作用具有劑量依賴性，且抑制率隨著藥物濃度增加而增加，混合藥物抑制率較單獨藥物高。進(jìn)一步驗證了黃芪注射液聯(lián)合阿維A作用強(qiáng)于黃芪注射液。

1 Zhang L，Yang XQ，Cheng J，et al.Increased Th17 cells are accompanied by FoxP3(+)Treg cell accumulation and correlated with psoriasis disease severity〔J〕Clin Immunol，2010;135(1):108-17.

2 Kagami S，Rizzo HL，Lee JJ，et al.Circulating Th17，Th22，and Th1 cells are increased in psoriasis〔J〕.J Invest Dermatol，2010;130(5):1373-83.

3 de Jager ME，de Jong EM，de Kerkhof PC，et al.Efficacy and safety of treatments for childhood psoriasis:a systematic literature review〔J〕.JAm Acad Dermatol，2010;62(6):1013-30.

4 Menter A.Goeckerman therapy versus biologics in the treatmentof psoriasis〔J〕.JAm Acad Dermatol，2010;62(3):516-7.

5 梁東風(fēng).抗TNF-α療法治療銀屑病關(guān)節(jié)炎和銀屑病〔J〕.中國藥物應(yīng)用與監(jiān)測，2005;2(3):39-42.

6 Chew AL，Smith BA，田中偉.阿達(dá)木單抗成功治療嚴(yán)重型銀屑病和銀屑病關(guān)節(jié)炎〔J〕.世界核心醫(yī)學(xué)期刊文摘(皮膚病學(xué)分冊)，2005;2(2):28.

7 陶 萍，聶洪邵，徐晴嬌，等.紫丹銀屑顆粒治療銀屑病的臨床觀察〔J〕. 齊魯藥事，2010，29(6):372-3.

8 羅素菊，彭振輝，鄭 焱，等.正常人角質(zhì)形成細(xì)胞維A酸受體γmRNA在依曲替酸處理前后的改變〔J〕.中國皮膚性病學(xué)雜志，2007;14(7):388-90.

R758.63

A

1005-9202(2012)12-2518-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.12.035

閆鐵夫(1972-)，男，主治醫(yī)師，主要從事皮膚醫(yī)學(xué)研究。

〔2011-02-17收稿 2011-07-05修回〕

(編輯 袁左鳴)