張 巖 王鐵栓 趙 松 (鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052)

趨化因子CXCL13在胸腺瘤合并重癥肌無力發(fā)病中的作用

張 巖 王鐵栓 趙 松 (鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052)

目的探討趨化因子CXCL13在胸腺瘤合并重癥肌無力患者發(fā)病中的作用。方法收集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科胸腺瘤合并重癥肌無力患者以及單純胸腺瘤患者(不合并有重癥肌無力及其他自身免疫性疾病)治療前和胸腺瘤切除治療2個月后及健康體檢者的血液標(biāo)本各50份，ELISA法檢測血清中CXCL13的水平，RT-PCR半定量法檢測各組胸腺瘤組織中的mRNA水平，采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，各組間比較采用單因素方差分析。結(jié)果50份胸腺瘤合并重癥肌無力患者血清中的CXCL13濃度明顯高于對照組(P＜0.05)，在接受胸腺切除手術(shù)2個月后，患者血清中CXCL13濃度較治療前下降(P＜0.05)，胸腺瘤合并重癥肌無力患者的胸腺瘤組織中CXCL13 mRNA的表達(dá)水平高于單純胸腺瘤患者的胸腺瘤組織(P＜0.05)。結(jié)論胸腺瘤伴重癥肌無力組與單純胸腺瘤組血清CXCL13水平和瘤體mRNA水平顯著差異，提示CXCL13在胸腺瘤伴重癥肌無力患者的發(fā)病中有重要意義。

胸腺瘤;重癥肌無力;CXCL13

重癥肌無力(MG)發(fā)病的重要機制是抗體作用于突觸后膜乙酰膽堿受體(AChR)，導(dǎo)致神經(jīng)肌肉交接處信號傳遞障礙〔1，2〕。B細(xì)胞在MG發(fā)病過程中扮演著重要的角色。趨化因子是能使細(xì)胞發(fā)生趨化作用的細(xì)胞因子的總稱，分為CXC亞家族和CC亞家族〔3〕。CXCL13，是CXC趨化因子家族成員之一。CXCL13及其受體在B淋巴細(xì)胞尋靶和淋巴組織中B細(xì)胞區(qū)的形成中有著重要作用〔4〕。有研究表明:MG患者CXCL13血清濃度明顯高于正常對照組，且在進(jìn)行激素治療或手術(shù)治療后其濃度較治療前明顯下降〔5〕。

但目前尚沒有研究報道CXCL13與胸腺瘤、MG的關(guān)系，因此，本文探尋CXCL13與胸腺瘤、MG發(fā)病的關(guān)系，為MG的發(fā)病機制以及治療方案的研究提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑RT-PCR試劑盒購自北京全式金生物有限公司，人CXCL13 ELISA kit購自美國R＆D公司。β-肌動蛋白(βactin)和CXCL13引物序列由上海博尚生物技術(shù)公司合成。

1.1.2 一般資料 收集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科2009年12月至2011年7月胸腺瘤合并MG患者以及單純胸腺瘤患者 (不合并有MG及其他自身免疫性疾病)治療前和胸腺瘤切除治療2個月后及健康體檢者的血液標(biāo)本各50份，標(biāo)本用無菌速凝管采集后靜置1 h后離心，取上清液1 ml轉(zhuǎn)置于環(huán)氧樹脂 (EP)管中。－20℃冰箱內(nèi)低溫保存。50例胸腺瘤并MG患者，年齡55～60〔平均 (63±6)〕歲，中位年齡37歲，男16例，女34例;患者有MG癥狀的時間為1 w～4年，以O(shè)sserman分型〔6〕:眼肌型 MG 26例，輕度全身型 MG 10例，中度全身型MG 14例。所有接受手術(shù)治療的病例經(jīng)術(shù)后病檢都確診為胸腺瘤。所有患者均根據(jù)臨床癥狀、新斯的明試驗、疲勞試驗、電生理檢查確診。就診前3個月內(nèi)曾使用激素或免疫抑制劑以及患有其他自身免疫性疾病病例，排除在本組之外。另外，同時收集上述患者的胸腺瘤組織標(biāo)本，標(biāo)本采集完畢后，立即置于EP管中，并放入液氮罐中保存，用于組織PCR。另外，收取本院心外科10例接受心臟病手術(shù)患者部分胸腺組織標(biāo)本作為對照組，標(biāo)本采集和保存方法同上。對照組患者性別、年齡均與試驗組患者相匹配，其中房間隔缺損修補術(shù)4例，室間隔缺損修補術(shù)4例，動脈導(dǎo)管結(jié)扎術(shù)2例。對照組所有患者各項體檢指標(biāo)正常，無其他合并疾患，且在3個月內(nèi)未使用過激素及免疫抑制劑。對照組標(biāo)本經(jīng)病理切片證實為正常胸腺組織。

1.2 方法

1.2.1 ELISA法測定血清中CXCL13濃度

1.2.1.1 實驗分組 A組為胸腺瘤合并MG患者術(shù)前血清;B組為胸腺瘤合并MG患者術(shù)后2個月血清;C組為單純胸腺瘤患者術(shù)前血清;D組為單純胸腺瘤患者術(shù)后2個月血清;E組為正?；颊哐濉?/p>

1.2.1.2 ELISA測定各組CXCL13血清濃度 用0.05 mol/L pH9.6的包被緩沖液稀釋，然后在每個ELISA板的孔中加0.1 m l，4℃過夜。次日，牛血清白蛋白(BAS)包被液封閉每孔的空位點，室溫反應(yīng)2 h。棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液沖洗4次，每次5 min。將預(yù)包被板條固定于板架上。每次試驗設(shè)陰性對照2孔、陽性對照2孔，分別加入陰、陽性對照100 pl;設(shè)空白對照1孔，只加入待檢樣品(血清標(biāo)本)稀釋液100 pl，其余孔加入100 pl待檢樣品稀釋液。震蕩混勻后37℃溫育2 h。棄液，將稀釋后的洗滌緩沖液注滿各孔，靜置30 s，棄去孔內(nèi)洗液，重復(fù)洗4次。每孔加底物溶液200 pl，37℃溫育30 min。避光。每孔加入終止液 50 pl，混勻。在 30 min內(nèi)，單波長450 nm，用空白孔校零，再讀取各孔OD值。每份血清標(biāo)本滴加兩孔分別檢測其OD值，取兩次的平均值作為實驗結(jié)果。

1.2.2 RT-PCR法檢測胸腺組織中CXCL13 mRNA表達(dá)水平

1.2.2.1 實驗分組 A組為胸腺瘤合并MG患者的瘤組織;B組為單純胸腺瘤患者的瘤組織;C組為正常胸腺組織。

1.2.2.2 RT-PCR 常規(guī)Trizol法提取A組、B組、C組胸腺組織總RNA，用RT試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲取組織 cDNA片段。PCR擴增目的CXCL13基因片段，CXCL13上游引物P1:5'-CTCTGCTTCTCATGCTGCTG-3'，下游引物 P2:5'-TGAGGGTCCACACACACAAT-3'。以β-actin作為內(nèi)參照，上游引物P3:5'-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3'，下游引物 P4:5'-CCCATACCACCATCACACC-3'。PCR 反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性 4 min，94℃變性 30 s，55℃退火 30 s，72℃ 延伸 90 s，30 個循環(huán)，72℃延伸6 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶。電泳后，將凝膠置于Tanon GIS.2020電泳凝膠圖像分析儀中測量各產(chǎn)物的光密度值，目的基因條帶的平均灰度值與相應(yīng)的內(nèi)參條帶的平均灰度值的比值為CXCL13 mRNA含量水平的相對值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，實驗結(jié)果以±s表示，各組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。

2 結(jié)果

2.1 ELISA測定血清CXCL13濃度結(jié)果 A組、B組、C組、D組、E組血清中CXCL13的濃度(ng/m l)分別為3.57±0.18，2.52±0.23，0.60±0.21，0.62±0.18，0.49±0.17;經(jīng) LSD 兩兩比較，A組與B組、C組、E組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，B、C、D三組與E組相比均有統(tǒng)計學(xué)意義。C組與D組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。其中眼肌型、輕度全身型、中度全身型胸腺瘤合并 MG患者，術(shù)前血清中 CXCL13的濃度(ng/m l)分別為3.60±0.21，3.59±0.11和 3.50±0.18，各組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，術(shù)后2個月血清中CXCL13的濃度(ng/m l)分別為2.47±0.28，2.50±0.19和2.59±0.18，兩兩比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2 胸腺組織中CXCL13 mRNA表達(dá)水平 應(yīng)用RT-PCR方法得到的胸腺組織CXCL13產(chǎn)物為719 bp，內(nèi)參照β-actin為207 Bp。合并MG的胸腺瘤組織CXCL13 mRNA表達(dá)水平(1.48±0.14)明顯高于不合并MG的胸腺瘤組織(0.49±0.11)及正常對照組的胸腺瘤組織(0.50±0.09)(P＜0.01)。見圖1。

圖1 A、B、C三組胸腺組織CXCL13 m RNA表達(dá)電泳圖

3 討論

MG是由AChR-Ab介導(dǎo)的，補體參與，細(xì)胞免疫依賴性，針對神經(jīng)肌肉接頭處突觸后膜上AChR-Ab的自身免疫性疾病。AChR特異性T細(xì)胞活化并輔助B細(xì)胞產(chǎn)生AChR-Ab是本病的始動環(huán)節(jié)〔7，8〕。而B淋巴細(xì)胞也是在逃避了免疫清除作用之后產(chǎn)生了AChR-Ab。CXCL13發(fā)現(xiàn)于1998年，是CXC趨化因子家族成員之一，也被稱為B細(xì)胞吸附因子I或B細(xì)胞趨化因子，CXCL13及其受體在B淋巴細(xì)胞尋靶和淋巴組織中B細(xì)胞區(qū)的形成中有著重要作用。有文獻(xiàn)表明:MG患者血清中CXCL13水平明顯升高，且有胸腺增生的患者的胸腺組織CXCL13 mRNA表達(dá)水平增高〔5〕。推測CXCLl3水平明顯升高，使B淋巴細(xì)胞趨化，分泌產(chǎn)生大量AChR，使患者出現(xiàn)了一系列MG的癥狀。但目前尚無MG、胸腺瘤、CXCL13三者關(guān)系的研究。

胸腺瘤患者中33% ～75%合并MG，而另外一部分無MG癥狀〔9〕。本實驗通過對比胸腺瘤并MG及單純胸腺瘤患者治療前后血清中CXCL13的水平及胸腺瘤組織中CXCL13的mRNA水平得到以下結(jié)果:(1)胸腺瘤并MG患者術(shù)前血清中CXCL13高于單純胸腺瘤患者。經(jīng)手術(shù)治療后胸腺瘤并MG患者血清中CXCL13水平下降，而單純胸腺瘤的患者術(shù)后血清中CXCL13水平無顯著差異。(2)治療2個月后，胸腺瘤合并MG患者血清中CXCL13總體水平仍高于正常對照組，推測是由于其他組織也在產(chǎn)生CXCL13的緣故，這個問題還有待于進(jìn)一步的研究;(3)在實驗中還發(fā)現(xiàn)，不同類型MG患者的血清中CXCL13水平無明顯差異，提示了CXCL13與MG的臨床發(fā)病類型及嚴(yán)重程度無明顯相關(guān)性。(4)合并有MG的胸腺瘤組織中CXCL13 mRNA的表達(dá)較單純胸腺瘤組織明顯增高。(5)單純胸腺瘤患者體內(nèi)CXCL13總體水平高于正常對照組，但未出現(xiàn)MG及其他免疫性疾病的癥狀，其原因尚需進(jìn)一步探討。

本實驗結(jié)果證實了CXCL13可使B淋巴細(xì)胞趨化，分泌產(chǎn)生大量AChR，可能是MG發(fā)病機制中的一個重要環(huán)節(jié)。然而是什么因素導(dǎo)致了胸腺或胸腺瘤組織中CXCL13 mRNA的過表達(dá)，其可能的分子機制是什么，這些問題尚待研究。目前，糖皮質(zhì)激素及手術(shù)治療仍然是治療MG的兩個主要手段，但是二者都有各自的缺陷。糖皮質(zhì)激素雖然可以取得一定的療效，暫時緩解病情，但是不能有效地防止疾病的復(fù)發(fā)與進(jìn)展，并且易使患者的免疫系統(tǒng)受到全面抑制而招致嚴(yán)重感染、骨髓抑制甚至可能加重MG癥狀。手術(shù)治療對患者創(chuàng)傷較大，花費相對較高，只能在有條件的醫(yī)院開展。雖然隨著手術(shù)水平的提高，胸腺瘤的切除率越來越高，但圍術(shù)期常出現(xiàn)呼吸道感染、肌無力危象、重要臟器的功能障礙及手術(shù)切口愈合不良等手術(shù)并發(fā)癥。因此，需要尋找一條新的、有效的治療途徑。關(guān)于CXCL13的研究，可能為MG的治療提供一個新的靶點。

1 Gilhus NE，Owe JF，Hoff JM，et al.Myasthenia gravis:a review of available treatment approaches〔J〕.Autoimmune Dis，2011;2011:847393.

2 Yoshikawa H，Iwasa K，Takamori M.Current status and future prospects of therapy for myasthenia gravis:considering thymectomy〔J〕.Brain Nerve，2011;63(7):729-36.

3 鄭 紅.趨化因子及其受體的功能〔J〕.免疫學(xué)雜志，2004;20(1):1-9.

4 道書艷，郭葆玉.趨化因子CXCL13及其受體CXCR5研究進(jìn)展〔J〕.國外醫(yī)學(xué)(分子生物學(xué)分冊)，2003;4:200-3.

5 周 方.CXCL13與重癥肌無力的相關(guān)性研究及實驗性自身免疫性重癥肌無力小鼠模型的建立〔D〕.中南大學(xué)(碩士論文)，2009.

6 Osserman KE.Myasthenia Gravis〔M〕.New York:Grune Stratton，1958:100.

7 王云甫，孫圣剛.重癥肌無力的研究現(xiàn)狀〔J〕.臨床內(nèi)科雜志，2004;21(1):68-70.

8 賴祥青，楊明山，徐金枝，等.重癥肌無力患者免疫發(fā)病機理的研究〔J〕.中國病理生理雜志，2001;17(7):662-4.

9 陳云新，王新允，王愛香，等.胸腺瘤組織學(xué)分型與重癥肌無力及臨床分期關(guān)系〔J〕.中國癌癥雜志，2005;15(1):55-6.

R746.1

A

1005-9202(2012)12-2484-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.12.017

王鐵栓(1952-)，男，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事胸外科基礎(chǔ)與臨床研究。

張 巖(1984-)，男，在讀碩士，主要從事胸外科基礎(chǔ)與臨床研究。

〔2011-08-18收稿 2011-12-10修回〕

(編輯 袁左鳴)