張 進(jìn) (山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，山東 濟(jì)南 250062)

前列腺癌組織miR-221和miR-222的表達(dá)及臨床意義

張 進(jìn) (山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，山東 濟(jì)南 250062)

目的探討前列腺癌(PCa)組織中miR-221和miR-222的表達(dá)及其臨床意義。方法采用莖環(huán)RT-PCR的方法檢測(cè)8例正常前列腺組織、74例PCa組織及其對(duì)應(yīng)的癌旁組織中miR-221和miR-222的表達(dá)情況，并結(jié)合臨床病理資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果miR-221和miR-222在PCa組織中的表達(dá)顯著高于其對(duì)應(yīng)癌旁組織(P＜0.05)及正常前列腺組織(P＜0.05)，其中miR-221的水平還與癌組織分化程度(P＜0.05)以及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移情況(P＜0.05)相關(guān)。結(jié)論miR-221和miR-222在PCa組織中表達(dá)量升高，其中miR-221的水平還與癌組織分化程度與轉(zhuǎn)移相關(guān)，可能作為PCa診斷和預(yù)后的指標(biāo)。

前列腺癌;miR-221;miR-222

前列腺癌(PCa)是男性泌尿生殖系統(tǒng)一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，具有潛伏期長(zhǎng)、發(fā)病率高的特點(diǎn)，且發(fā)現(xiàn)時(shí)常常已經(jīng)是晚期〔1〕，目前尚無(wú)有效的早期檢測(cè)手段〔2〕。真核生物中 miRNA廣泛參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育〔3〕、胰島素分泌和脂肪細(xì)胞調(diào)控〔4〕、造血和紅系分化〔5〕、細(xì)胞凋亡和腫瘤形成〔6〕等生物學(xué)過(guò)程，也有研究提出將miRNA作為腫瘤分子標(biāo)記物輔助癌癥的診斷和預(yù)后〔7〕。miR-221與miR-222是兩種與腫瘤發(fā)生關(guān)系非常密切的miRNA，研究發(fā)現(xiàn)miR-221和miR-222表達(dá)失調(diào)與許多腫瘤相關(guān)〔8～10〕。本研究旨在通過(guò)莖環(huán) RT-PCR的方法檢測(cè)PCa樣本中miR-221和miR-222的表達(dá)情況，并分析兩者與病人臨床資料的相關(guān)性，探討這兩種小分子RNA在PCa發(fā)生發(fā)展中的作用及臨床應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 對(duì)象 收集某醫(yī)院2005年2月至2011年4月經(jīng)直腸的前列腺穿刺活檢和手術(shù)切除后液氮保存標(biāo)本，均經(jīng)病理組織學(xué)確診為PCa的組織及其癌旁組織，各74例(其中有遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的24例)，另有8例正常前列腺組織作對(duì)照。組織保存方式為液氮凍存30 min后放入－80℃保存。

1.1.2 試劑與儀器 Trizol(Invitrogen)，鼠白血病病毒(MMLV)反轉(zhuǎn)錄酶、RNA 酶抑制劑、dNTPs、SYBR Mastermix(Toyobo)、ABI7500熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)，分光光度儀(EPPENDORF)。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取 ?。?0℃保存的組織標(biāo)本在液氮中碾碎至粉狀，加氯仿0.2 ml，劇烈震蕩后室溫靜置 3 min，4℃12 000 r/min離心15min，取上清液約300～500μl移至新的EP管中;加500μl異丙醇，混勻后在碎冰中放置20 min;－20℃12 000 r/min離心120 min，去上清取沉淀，加1 m l 75%乙醇漂洗，4℃ 7 500 r/min離心5 min;吸去乙醇，空甩離心后再次吸盡乙醇，開(kāi)蓋室溫晾干約5 min;加入焦碳酸乙二酯(DEPC)處理過(guò)的水20μl溶解，震蕩混勻。采用德國(guó)Eppendorf公司分光光度儀(Biophotometer)檢測(cè) RNA溶液 OD260/OD280吸光值，計(jì)算RNA濃度和純度，OD260/OD280＞1.8為合格，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn);取2～5μg總RNA加入6 ×RNA loading buffer，1%瓊脂糖電泳分析，其28 S與18 S條帶亮度約為2∶1。

1.2.2 miRNA表達(dá)分析 以U6作為內(nèi)參，分析miR-221及miR-222表達(dá)。RT-PCR所用引物由上海生工合成，具體序列見(jiàn)表1。取1μg總RNA以miR-221和miR-222莖環(huán)RT引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄;逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)條件為16℃ 30 min，42℃ 30 min，75℃15 min，反應(yīng)結(jié)束后－20℃保存。以15μl的反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR miRNA，反應(yīng)體系包括 1μl RT產(chǎn)物，1× SYBR GreenⅠ Mastermix，0.5 μmol/L miRNA 特 異 前向引物，0.5μmol/L通用的反向引物;實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)條件為95℃10 min，40 個(gè)循環(huán)(95℃ 15 s，60℃ 1 min)，每個(gè)樣品做 3 個(gè)復(fù)孔，ABI7500熒光定量PCR儀記錄每個(gè)反應(yīng)管中的熒光信號(hào)到達(dá)所設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，即Ct值，以U6為內(nèi)參，以N=2－△Ct表示目的 miRNA的相對(duì)表達(dá)量。見(jiàn)表1。

表1 RT及PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，配對(duì)比較使用非參數(shù)Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)，PCa組間比較使用Mann Whitney U檢驗(yàn);PCa組織中miR-221和miR-222與各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 miR-221和miR-222在PCa組織中的表達(dá) miR-221和miR-222在PCa中的相對(duì)表達(dá)量中位數(shù)分別為501.5和570.1，均高于對(duì)應(yīng)癌旁組織，采用配對(duì)樣本的Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)其差異有顯著性(P＜0.05)，即在PCa組織中miR-221和miR-222的表達(dá)量均顯著高于癌旁組織及正常前列腺組織。見(jiàn)圖1。

2.2 miR-221與miR-222表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 如表2所示，miR-221與miR-222在PCa組織中表達(dá)量一般高于其對(duì)應(yīng)的癌旁組織，取癌組織對(duì)應(yīng)癌旁組織中miR-221表達(dá)量上調(diào)倍數(shù)2倍以上的病例記為陽(yáng)性(39例)，其余病例記為陰性(35例);同樣的處理方式得到miR-221陽(yáng)性病例37例，陰性病例37例。比較miR-221的表達(dá)與各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)miR-221的表達(dá)和腫瘤的分化程度以及有無(wú)轉(zhuǎn)移相關(guān)。在分化程度低的癌組織中miR-221的表達(dá)量常高于其對(duì)應(yīng)癌旁組織，而癌組織分化程度越高，其miR-221的表達(dá)水平與其對(duì)應(yīng)癌旁組織的差別就越小。另外，在有遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的PCa病例中miR-221的陽(yáng)性率顯著高于沒(méi)有遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的病例。

3 討論

miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，在近年來(lái)PCa 的研究中，關(guān)于 miRNA 的內(nèi)容也越來(lái)越多〔11，12〕。miR-221與 miR-222 是兩種非常重要的 miRNA，在乳腺癌〔13，14〕、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤〔15〕、慢性淋巴細(xì)胞性白血病〔16〕、甲狀腺癌〔10〕中均起著重要的作用，其中對(duì)于miR-221與miR-222在PCa中的研究近幾年也漸漸展開(kāi)，但是關(guān)于miR-221與miR-222在PCa中具體的臨床應(yīng)用研究尚無(wú)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)miR-221和miR-222在PCa組織中的表達(dá)顯著高于其對(duì)應(yīng)癌旁組織及正常前列腺組織，提示miR-221和miR-222可能作為PCa的一個(gè)診斷指標(biāo);而miR-221的水平與癌組織分化程度以及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移情況相關(guān)，說(shuō)明miR-221可能在PCa的惡化進(jìn)展過(guò)程中扮演重要角色。結(jié)合 miR-221 下游靶基因，如 p27〔8，10，16〕、p57〔8〕以及 Bmf〔9〕等基因的抑癌作用，本文結(jié)果推測(cè)miR-221隨著PCa惡化進(jìn)展而表達(dá)升高可能導(dǎo)致其下游一系列抑癌基因的沉默，從而對(duì)癌癥的進(jìn)一步惡化起了重要作用，而這種作用在多種癌癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中都可能普遍存在，正如前期在乳腺癌〔13，14〕、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤〔15〕、慢性淋巴細(xì)胞性白血病〔16〕、甲狀腺癌〔10〕相關(guān)臨床資料和細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)道中的那樣。但是由于miR-221下游靶基因非常多，上游也有核轉(zhuǎn)錄因子-KB(NF-KB)、c-Jun等調(diào)控因子控制調(diào)節(jié)〔17〕，這些基因間直接或間接的相互作用非?？赡苄纬梢粋€(gè)復(fù)雜的交互調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，影響了在有限實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)下對(duì)miR-221在PCa發(fā)生發(fā)展中具體作用機(jī)制的解釋?？傊?，本研究揭示出miR-221和miR-222在PCa組織中表達(dá)量升高，以及miR-221的水平與癌組織分化程度、轉(zhuǎn)移情況的相關(guān)性，可能為其作為PCa診斷和預(yù)后指標(biāo)提供依據(jù)。

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R737

A

1005-9202(2012)12-2472-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.12.011

張 進(jìn)(1982-)，女，講師，主要從事免疫學(xué)研究。

〔2011-09-25收稿 2011-12-16修回〕

(編輯 袁左鳴/徐 杰)