張 進 (山東省醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所，山東 濟南 250062)

前列腺癌組織miR-221和miR-222的表達及臨床意義

張 進 (山東省醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所，山東 濟南 250062)

目的探討前列腺癌(PCa)組織中miR-221和miR-222的表達及其臨床意義。方法采用莖環(huán)RT-PCR的方法檢測8例正常前列腺組織、74例PCa組織及其對應的癌旁組織中miR-221和miR-222的表達情況，并結(jié)合臨床病理資料進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果miR-221和miR-222在PCa組織中的表達顯著高于其對應癌旁組織(P＜0.05)及正常前列腺組織(P＜0.05)，其中miR-221的水平還與癌組織分化程度(P＜0.05)以及遠端轉(zhuǎn)移情況(P＜0.05)相關。結(jié)論miR-221和miR-222在PCa組織中表達量升高，其中miR-221的水平還與癌組織分化程度與轉(zhuǎn)移相關，可能作為PCa診斷和預后的指標。

前列腺癌;miR-221;miR-222

前列腺癌(PCa)是男性泌尿生殖系統(tǒng)一種常見的惡性腫瘤，具有潛伏期長、發(fā)病率高的特點，且發(fā)現(xiàn)時常常已經(jīng)是晚期〔1〕，目前尚無有效的早期檢測手段〔2〕。真核生物中 miRNA廣泛參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育〔3〕、胰島素分泌和脂肪細胞調(diào)控〔4〕、造血和紅系分化〔5〕、細胞凋亡和腫瘤形成〔6〕等生物學過程，也有研究提出將miRNA作為腫瘤分子標記物輔助癌癥的診斷和預后〔7〕。miR-221與miR-222是兩種與腫瘤發(fā)生關系非常密切的miRNA，研究發(fā)現(xiàn)miR-221和miR-222表達失調(diào)與許多腫瘤相關〔8～10〕。本研究旨在通過莖環(huán) RT-PCR的方法檢測PCa樣本中miR-221和miR-222的表達情況，并分析兩者與病人臨床資料的相關性，探討這兩種小分子RNA在PCa發(fā)生發(fā)展中的作用及臨床應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 對象 收集某醫(yī)院2005年2月至2011年4月經(jīng)直腸的前列腺穿刺活檢和手術切除后液氮保存標本，均經(jīng)病理組織學確診為PCa的組織及其癌旁組織，各74例(其中有遠端轉(zhuǎn)移的24例)，另有8例正常前列腺組織作對照。組織保存方式為液氮凍存30 min后放入－80℃保存。

1.1.2 試劑與儀器 Trizol(Invitrogen)，鼠白血病病毒(MMLV)反轉(zhuǎn)錄酶、RNA 酶抑制劑、dNTPs、SYBR Mastermix(Toyobo)、ABI7500熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)，分光光度儀(EPPENDORF)。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取 ?。?0℃保存的組織標本在液氮中碾碎至粉狀，加氯仿0.2 ml，劇烈震蕩后室溫靜置 3 min，4℃12 000 r/min離心15min，取上清液約300～500μl移至新的EP管中;加500μl異丙醇，混勻后在碎冰中放置20 min;－20℃12 000 r/min離心120 min，去上清取沉淀，加1 m l 75%乙醇漂洗，4℃ 7 500 r/min離心5 min;吸去乙醇，空甩離心后再次吸盡乙醇，開蓋室溫晾干約5 min;加入焦碳酸乙二酯(DEPC)處理過的水20μl溶解，震蕩混勻。采用德國Eppendorf公司分光光度儀(Biophotometer)檢測 RNA溶液 OD260/OD280吸光值，計算RNA濃度和純度，OD260/OD280＞1.8為合格，可用于后續(xù)實驗;取2～5μg總RNA加入6 ×RNA loading buffer，1%瓊脂糖電泳分析，其28 S與18 S條帶亮度約為2∶1。

1.2.2 miRNA表達分析 以U6作為內(nèi)參，分析miR-221及miR-222表達。RT-PCR所用引物由上海生工合成，具體序列見表1。取1μg總RNA以miR-221和miR-222莖環(huán)RT引物進行逆轉(zhuǎn)錄;逆轉(zhuǎn)錄的反應條件為16℃ 30 min，42℃ 30 min，75℃15 min，反應結(jié)束后－20℃保存。以15μl的反應體系進行實時定量PCR miRNA，反應體系包括 1μl RT產(chǎn)物，1× SYBR GreenⅠ Mastermix，0.5 μmol/L miRNA 特 異 前向引物，0.5μmol/L通用的反向引物;實時定量PCR反應條件為95℃10 min，40 個循環(huán)(95℃ 15 s，60℃ 1 min)，每個樣品做 3 個復孔，ABI7500熒光定量PCR儀記錄每個反應管中的熒光信號到達所設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，即Ct值，以U6為內(nèi)參，以N=2－△Ct表示目的 miRNA的相對表達量。見表1。

表1 RT及PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，配對比較使用非參數(shù)Wilcoxon符號秩檢驗，PCa組間比較使用Mann Whitney U檢驗;PCa組織中miR-221和miR-222與各臨床病理參數(shù)之間的關系采用χ2檢驗或Fisher精確概率法進行統(tǒng)計學檢驗。

2 結(jié)果

2.1 miR-221和miR-222在PCa組織中的表達 miR-221和miR-222在PCa中的相對表達量中位數(shù)分別為501.5和570.1，均高于對應癌旁組織，采用配對樣本的Wilcoxon符號秩檢驗其差異有顯著性(P＜0.05)，即在PCa組織中miR-221和miR-222的表達量均顯著高于癌旁組織及正常前列腺組織。見圖1。

2.2 miR-221與miR-222表達與臨床病理特征的關系 如表2所示，miR-221與miR-222在PCa組織中表達量一般高于其對應的癌旁組織，取癌組織對應癌旁組織中miR-221表達量上調(diào)倍數(shù)2倍以上的病例記為陽性(39例)，其余病例記為陰性(35例);同樣的處理方式得到miR-221陽性病例37例，陰性病例37例。比較miR-221的表達與各臨床病理參數(shù)之間的關系，發(fā)現(xiàn)miR-221的表達和腫瘤的分化程度以及有無轉(zhuǎn)移相關。在分化程度低的癌組織中miR-221的表達量常高于其對應癌旁組織，而癌組織分化程度越高，其miR-221的表達水平與其對應癌旁組織的差別就越小。另外，在有遠端轉(zhuǎn)移的PCa病例中miR-221的陽性率顯著高于沒有遠端轉(zhuǎn)移的病例。

3 討論

miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，在近年來PCa 的研究中，關于 miRNA 的內(nèi)容也越來越多〔11，12〕。miR-221與 miR-222 是兩種非常重要的 miRNA，在乳腺癌〔13，14〕、膠質(zhì)母細胞瘤〔15〕、慢性淋巴細胞性白血病〔16〕、甲狀腺癌〔10〕中均起著重要的作用，其中對于miR-221與miR-222在PCa中的研究近幾年也漸漸展開，但是關于miR-221與miR-222在PCa中具體的臨床應用研究尚無報道。本研究發(fā)現(xiàn)miR-221和miR-222在PCa組織中的表達顯著高于其對應癌旁組織及正常前列腺組織，提示miR-221和miR-222可能作為PCa的一個診斷指標;而miR-221的水平與癌組織分化程度以及遠端轉(zhuǎn)移情況相關，說明miR-221可能在PCa的惡化進展過程中扮演重要角色。結(jié)合 miR-221 下游靶基因，如 p27〔8，10，16〕、p57〔8〕以及 Bmf〔9〕等基因的抑癌作用，本文結(jié)果推測miR-221隨著PCa惡化進展而表達升高可能導致其下游一系列抑癌基因的沉默，從而對癌癥的進一步惡化起了重要作用，而這種作用在多種癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中都可能普遍存在，正如前期在乳腺癌〔13，14〕、膠質(zhì)母細胞瘤〔15〕、慢性淋巴細胞性白血病〔16〕、甲狀腺癌〔10〕相關臨床資料和細胞學實驗報道中的那樣。但是由于miR-221下游靶基因非常多，上游也有核轉(zhuǎn)錄因子-KB(NF-KB)、c-Jun等調(diào)控因子控制調(diào)節(jié)〔17〕，這些基因間直接或間接的相互作用非?？赡苄纬梢粋€復雜的交互調(diào)控網(wǎng)絡，影響了在有限實驗數(shù)據(jù)下對miR-221在PCa發(fā)生發(fā)展中具體作用機制的解釋。總之，本研究揭示出miR-221和miR-222在PCa組織中表達量升高，以及miR-221的水平與癌組織分化程度、轉(zhuǎn)移情況的相關性，可能為其作為PCa診斷和預后指標提供依據(jù)。

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R737

A

1005-9202(2012)12-2472-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.12.011

張 進(1982-)，女，講師，主要從事免疫學研究。

〔2011-09-25收稿 2011-12-16修回〕

(編輯 袁左鳴/徐 杰)