李子勇，老錦雄，鄧 聰

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬佛山市中醫(yī)院，廣東佛山528000)

針刺對家兔骨折后不同時相膜內(nèi)成骨的骨形態(tài)計量學(xué)參數(shù)的影響*

李子勇，老錦雄，鄧 聰

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬佛山市中醫(yī)院，廣東佛山528000)

目的:研究針刺對家兔骨折后不同時相膜內(nèi)成骨的骨形態(tài)計量學(xué)參數(shù)的影響。方法:建立家兔右側(cè)橈骨骨折模型，針刺雙側(cè)肝俞、腎俞、后三里及對側(cè)前三里、四瀆、外關(guān)，在不同時相(骨折后1.5 w、3 w、5 w)處死家兔，制作成骨痂標(biāo)本，采用KSS image圖像分析系統(tǒng)，測量膜內(nèi)成骨的靜態(tài)參數(shù)和動態(tài)參數(shù)。結(jié)果:在骨折早、中期，針刺促進(jìn)家兔骨折膜內(nèi)成骨的骨轉(zhuǎn)換和骨形成，而在骨折后期，針刺對膜內(nèi)成骨的骨組織形態(tài)計量學(xué)參數(shù)無明顯影響。結(jié)論:針刺可以促進(jìn)家兔骨折早期和中期膜內(nèi)成骨骨痂形成的速度，但對骨量無明顯影響。

針刺;骨折;膜內(nèi)成骨;骨形態(tài)計量學(xué)

如何早期促進(jìn)骨折愈合一直是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的重點課題。大量學(xué)者根據(jù)中醫(yī)理論體系和現(xiàn)代科技成果，采用各種不同實驗手段和方法，從不同角度深入研究了中醫(yī)藥促進(jìn)骨折愈合的療效，取得較為理想的結(jié)果。從目前臨床及實驗所見，中藥對于骨折的干預(yù)治療占了絕大部分的比例，但作為中醫(yī)藥重要部分的針灸治療，對于骨折愈合干預(yù)的報道不甚多，本次實驗嘗試通過測量骨形態(tài)計量學(xué)參數(shù)，從針刺對家兔骨折后不同時相膜內(nèi)成骨骨痂形成的影響，探討針灸對于促進(jìn)骨痂愈合的有效性及相關(guān)機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及飼養(yǎng)條件

54只雄性新西蘭兔(由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供)體重為2`2.5 kg，普通級，單籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)籠規(guī)格為87×47×38 cm3，保證動物有足夠的活動空間，使用標(biāo)準(zhǔn)飼料(由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供)，所有動物自由攝食、攝水，在24℃～28℃、通風(fēng)良好、濕度60%～80%的條件下飼養(yǎng)。

1.2 實驗分組及給藥方法

54只雄性新西蘭兔全部造成右側(cè)橈骨中下1/3旋前圓肌止點處3 mm缺損的骨折模型，然后按體重隨機(jī)分為3組，每組18只。各組兔在造模后1.5 w、3 w、5 w時處死6只，分別留取骨折標(biāo)本和血標(biāo)本。

1.3 藥品及儀器

鈣黃綠素、鹽酸四環(huán)素及Goldner’s燃料試劑均購自美國的Sigma公司;甲基丙烯酸甲酯購自北京市化工廠;鄰苯二甲酸二丁酯購自天津市化學(xué)試劑一廠;過氧化苯甲酰購自廣州化學(xué)試劑廠。傷科接骨片為大連美羅中藥廠產(chǎn)品，批號為200405209。堿性磷酸酶為中生北控科技股份有限公司產(chǎn)品，批號為050101。一次性管狀針灸針購自蘇州環(huán)球醫(yī)療器械有限公司，標(biāo)準(zhǔn)號為GB2024。美國產(chǎn)低速鋸(Buehler LTD);德國產(chǎn)硬組織切片機(jī)(Leica2155);德國產(chǎn)碳化鎢鋼刀(Leica2155);日本產(chǎn)自動化圖像數(shù)字化分析儀包括光鏡和熒光顯微鏡(Nikon);美國的骨組織形態(tài)計量學(xué)測量軟件(KSS Scientific Consultant，UT)。

1.4 實驗方法

1.4.1 造模方法 應(yīng)用30 mg/kg的戊巴比妥鈉耳緣靜脈麻醉家兔后，去毛，消毒手術(shù)野，鋪無菌巾。在右側(cè)前肢中下段內(nèi)側(cè)作縱形切口，逐層切開皮膚，劈開皮下組織，鈍性分離肌肉;在橈骨中下1/3旋前圓肌止點3 mm用牙科電鉆作3 mm缺損口，保留尺骨完整，縫合皮膚。手術(shù)留取骨標(biāo)本包扎，后以夾板固定，造模即日起每日每只家兔肌注青霉素40萬單位，連續(xù)3天，5天后拆除皮膚縫線。

1.4.2 針刺方法 取家兔雙側(cè)肝俞、腎俞、后三里和對側(cè)前三里、四瀆、外關(guān)進(jìn)行針刺，刺后提插捻轉(zhuǎn)不留針，取穴參照《實驗針灸學(xué)》中兔針灸穴位，每日早上1次。

1.4.3 標(biāo)本的制作 處死前第14、13天腹腔注射四環(huán)素30 mg/kg，第4、3天再注射鈣黃綠素5 mg/kg，家兔用戊巴比妥鈉麻醉后心臟抽血處死。離斷右前肢，剔除軟組織，完整取出橈骨中部骨痂部分，用低速鋸沿縱切面鋸開，然后進(jìn)行不脫鈣包埋。包埋塊用硬組織切片機(jī)分別切下5 um和10 um切片，5 um骨薄片采用Masson－Goldner Trichrome染色方法，染色后用半自動圖像數(shù)字化分析儀測量骨組織形態(tài)計量學(xué)靜態(tài)參數(shù)。10 um骨厚片直接封片采用半自動圖像數(shù)字化分析儀測量骨組織形態(tài)計量學(xué)動態(tài)參數(shù)。

1.4.4 骨組織形態(tài)計量學(xué)測定 利用KSS Image圖像分析系統(tǒng)，按照國際骨形態(tài)計量學(xué)參數(shù)測量的定義和計算標(biāo)準(zhǔn)，測量家兔膜內(nèi)成骨的靜態(tài)參數(shù)和動態(tài)參數(shù)值。靜態(tài)參數(shù)包括:骨小梁面積百分?jǐn)?shù)(Tb.Ar，%)、骨小梁數(shù)量(Tb.N，#m，%)、骨小梁厚度(Tb.Th，um)及骨小梁分離度(Tb.Sp，um)。動態(tài)參數(shù)包括:標(biāo)記周長百分?jǐn)?shù)(L.Pm，%)、骨礦化沉積率(MAR，um/d)、骨形成率BFR/BS(骨表面形成率，%/ year)、骨形成率BFR/BV(骨轉(zhuǎn)換程度，%/year)、骨形成率BFR/TV(骨組織形成率，%/year)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)用SPSS軟件進(jìn)行分析，以P＜0.05、P＜0.01表示具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 家兔骨折早期(1.5 w)膜內(nèi)成骨的骨形態(tài)計量學(xué)靜態(tài)及動態(tài)參數(shù)的變化

骨折早期針刺組和傷科組骨小梁數(shù)量增加，而骨小梁分離度、熒光周長百分?jǐn)?shù)和骨轉(zhuǎn)換率均降低(P＜0.01或P＜0.05)。詳見表1、2。

表1 家兔骨折早期(1.5 w)膜內(nèi)成骨的骨形態(tài)計量學(xué)靜態(tài)參數(shù)的變化情況(±s，n=6)

表1 家兔骨折早期(1.5 w)膜內(nèi)成骨的骨形態(tài)計量學(xué)靜態(tài)參數(shù)的變化情況(±s，n=6)

注:與模型組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別 %Tb.Ar，% Tb.Th，um Tb.N，#m Tb.Sp，um模型組 2.19±0.31 54.08±12.58 0.44±0.16 2556.8±1001.00傷科組 30.17±25.43 163.22±132.50 1.80±0.48* 451.81±289.17*針刺組 23.26±17.07 135.45±95.43 1.66±0.23＊＊ 480.27±161.62＊＊

表2 家兔骨折早期(1.5 w)膜內(nèi)成骨的骨形態(tài)計量學(xué)動態(tài)參數(shù)的變化(±s，n=6)

表2 家兔骨折早期(1.5 w)膜內(nèi)成骨的骨形態(tài)計量學(xué)動態(tài)參數(shù)的變化(±s，n=6)

注:與模型組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別 %L.Pm，% MAR，um/d BFR/TV BFR/BV BFR/BS模型組 8.75±1.30 0.78±0.31 1.73±0.77 77.91±30.36 2.52±1.14傷科組 2.47±1.16* 0.72±0.13 2.23±1.56 10.86±10.09* 0.68±0.39針刺組 4.08±2.67* 0.59±0.07 2.46±1.82 12.86±8.81*0.90±0.63

2.2 家兔骨折中期(3 w)膜內(nèi)成骨的骨形態(tài)計量學(xué)靜態(tài)及動態(tài)參數(shù)的變化

骨折中期針刺組和傷科組熒光周長百分?jǐn)?shù)、骨礦化沉積率、骨形成率和骨轉(zhuǎn)換率均增加(P＜0.05或P＜0.01)。詳見表3、4。

2.3 家兔骨折后期(5 w)膜內(nèi)成骨的骨形態(tài)計量學(xué)靜態(tài)及動態(tài)參數(shù)的變化

骨折后期，針刺組和傷科組骨小梁厚度增加(P＜0.05)，而骨形成率和骨轉(zhuǎn)換率均降低(P＜0.05)。詳見表5、6。

表3 家兔骨折中期(3 w)膜內(nèi)成骨的骨形態(tài)計量學(xué)靜態(tài)參數(shù)的變化(±s，n=6)

表3 家兔骨折中期(3 w)膜內(nèi)成骨的骨形態(tài)計量學(xué)靜態(tài)參數(shù)的變化(±s，n=6)

組別 Tb.Ar，% Tb.Th，um Tb.N，#m Tb.Sp，um模型組 58.29±1.17 194.02±8.42 3.01±0.12 138.87±6.68傷科組 63.35±20.95 313.72±204.94 2.60±0.91 131.80±35.71針刺組 60.28±14.39 239.30±79.58 2.61±0.31 148.38±41.68

表4 家兔骨折中期(3 w)膜內(nèi)成骨的骨形態(tài)計量學(xué)動態(tài)參數(shù)的變化(±s，n=6)

表4 家兔骨折中期(3 w)膜內(nèi)成骨的骨形態(tài)計量學(xué)動態(tài)參數(shù)的變化(±s，n=6)

注:與模型組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別 %L.Pm，% MAR，um/d BFR/TV BFR/BV BFR/BS模型組 3.40±0.66 0.72±0.08 4.58±1.45 7.87±2.51 0.91±0.27傷科組 7.68±2.56* 0.71±0.08 8.26±2.87 15.47±7.83 1.96±0.62*針刺組 19.73±5.12＊＊ 0.93±0.03＊＊ 28.80±7.14＊＊ 52.12±21.70*6.67±1.66

表5 家兔骨折后期(5 w)膜內(nèi)成骨的骨形態(tài)計量學(xué)靜態(tài)參數(shù)的變化(±s，n=6)

表5 家兔骨折后期(5 w)膜內(nèi)成骨的骨形態(tài)計量學(xué)靜態(tài)參數(shù)的變化(±s，n=6)

注:與模型組比較，*P＜0.05。

組別 Tb.Ar，% Tb.Th，um Tb.N，#m Tb.Sp，um模型組 63.13±15.76 258.90±88.49 2.52±0.38 148.54±64.62傷科組 72.32±6.22 394.15±100.21 1.93±0.40 144.65±25.34針刺組 73.23±9.97 543.12±168.23*1.43±0.28 182.57±38.97

表6 家兔骨折后期(5 w)膜內(nèi)成骨的骨形態(tài)計量學(xué)動態(tài)參數(shù)的變化(±s，n=6)

表6 家兔骨折后期(5 w)膜內(nèi)成骨的骨形態(tài)計量學(xué)動態(tài)參數(shù)的變化(±s，n=6)

注:與模型組比較，*P＜0.05。

組別 %L.Pm，% MAR，um/d BFR/TV BFR/BV BFR/BS模型組 19.54±9.98 1.11±0.23 31.08±12.57 51.63±18.93 8.07±4.61傷科組 9.12±1.70 0.82±0.17 9.04±3.89* 12.77±6.32* 2.72±0.67針刺組 9.41±3.11 0.69±0.13 5.78±2.75* 8.62±5.31*2.32±0.84

3 討論

既往研究的主要成果有中藥改善骨折部位的血液供應(yīng)，促進(jìn)局部血腫的吸收與機(jī)化;促進(jìn)骨折部位骨基質(zhì)鈣鹽沉積;提高骨痂的質(zhì)量及生物力學(xué)性能;提高微量元素含量等。在針灸治療骨折的療效研究手段方面，以往主要應(yīng)用形態(tài)學(xué)進(jìn)行研究，而尚未報道應(yīng)用骨形態(tài)計量學(xué)定量研究針灸對骨折的影響。筆者本次針灸對骨折骨痂形成的影響的研究中，就融入了應(yīng)用骨形態(tài)計量學(xué)方法，對骨折愈合中骨痂組織形態(tài)計量分析內(nèi)、外骨痂面積和礦化小梁面積、軟骨骨痂面積等，從而使得過去的“定性”或間接認(rèn)識上升到“定量”或直接認(rèn)識的新高度，能從更客觀的角度去研究認(rèn)識針灸促進(jìn)骨折愈合的機(jī)理和療效［1～2］。

本次研究中，骨折早期針刺組骨小梁數(shù)量增加，而骨小梁分離度、熒光周長百分?jǐn)?shù)和骨轉(zhuǎn)化率均降低，提示針刺可以抑制家兔骨折早期膜內(nèi)成骨的骨礦化和骨轉(zhuǎn)換，從而使骨小梁數(shù)量增加和骨小梁結(jié)構(gòu)變得致密。骨折中期針刺組熒光周長百分?jǐn)?shù)、骨礦化沉積率、骨形成率和骨轉(zhuǎn)換率均增加(P＜0.05或P＜0.01)，提示針刺可顯著促進(jìn)家兔骨折中期膜內(nèi)成骨的骨礦化、骨形成和骨轉(zhuǎn)換。到了骨折后期，針刺組骨小梁厚度增加(P＜0.05)，而骨形成率和骨轉(zhuǎn)換率均降低(P＜0.05)，提示針刺可以抑制家兔骨折后期膜內(nèi)成骨的骨形成和骨轉(zhuǎn)換，從而使骨小梁厚度增加。

骨折愈合有其內(nèi)在的規(guī)律，可以通過促進(jìn)其中對骨折愈合修復(fù)起作用的因素來達(dá)到目的。針灸通過骨折愈合不同時期發(fā)揮修復(fù)作用。按骨折愈合過程，在血腫機(jī)化期，針刺具有活血化瘀作用的穴位，可加快微循環(huán)血流速度，增加毛細(xì)血管網(wǎng)的通透性，從而改善骨折斷端局部血液循環(huán)，清除局部血凝塊及代謝產(chǎn)物［3］。在骨痂形成期，骨折斷端由于局部缺氧，機(jī)體通過正常代償反應(yīng)誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞線粒體中鈣離子釋放于基質(zhì)中，刺激成骨細(xì)胞分化繁殖，從而調(diào)節(jié)豐富膠原、鈣鹽和微量元素的代謝過程，也可改善蛋白及代謝，促進(jìn)蛋白質(zhì)多糖合成及鈣化，以順利完成新骨的爬行替代過程［4］。

本次實驗提示，針刺對骨折后早、中期膜內(nèi)成骨的骨痂形成有一定促進(jìn)作用，對后期的骨痂形成則未見明顯影響，且不能明顯增加骨量，故此有關(guān)針刺對骨折后骨痂的實驗與臨床研究，尚有待從更多角度和層面進(jìn)行觀察，以揭示更多有關(guān)針刺對骨折骨痂形成的相關(guān)機(jī)理。

［1］李心沁，王淋.針灸促進(jìn)骨折愈合機(jī)理的研究現(xiàn)狀［J］.中醫(yī)正骨，2008，20(12):67

［2］張猛，潘良春.雙龍接骨丸對SD大鼠骨折愈合影響的實驗研究［J］.實用藥物與臨床，2007，10(5):267－269

［3］許小志，許志強(qiáng)，方耀忠，等.骨九方促進(jìn)骨折愈合臨床研究［J］.新中醫(yī)，2010，42(11):52

［4］劉濱生.前臂骨折后期的輔助針刺療法［J］.針灸臨床雜志，2002，18(6):16

Influence of Acupuncture in Different Phases on Bone Histomorphometry Parameters of Intramembranous after Fracture

LI Zi－yong，LAO Jin－xiong，DENG Cong
(Foshan Hospital of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)oshan528000，China)

Objective:To study the influence on bone histomorphometry parameters in intramembranous and ossification of rabbits with radius fracture in different phases of acupuncture.Methods:The rabbit models with right radius fracture were established，through acupuncturing bilateral Ganshu，Shenshu，Housanli and Qiansanli，Sidu and Waiguan，then the models were killed in different phases and made into samples，eventually bone histomorphometry parameters were analyzed with KSS image analyzing system.Results:During the early and medium phases after fracture，acupuncture resulted in more stimulation of bone configuration and transformation in rabbit models，however，there was no significance on these parameters during the last phase.Conclusion:Acupuncture has a certain effect on stimulating the callus formation in the early and medium phases but no influence on increasing the bone volume.

Acupuncture;Fracture;Intramembranous;Bone histomorphometry

R246.2

A

1005－0779(2012)006－0050－03

廣東省中醫(yī)藥管理局立項課題，編號:99632。

李子勇(1974－)，男，副主任醫(yī)師，研究方向:針灸治療痛癥及內(nèi)分泌紊亂疾病。

2011－06－30