李育卿，魏玉輝，周 燕，王 丹，張 帆，武新安

(1.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院藥劑科，蘭州 730000；2.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，蘭州 730000)

鏈脲佐菌素能夠快速而穩(wěn)定地選擇性破壞胰島β細(xì)胞功能，誘發(fā)大鼠實(shí)驗(yàn)性糖尿病模型的常用藥物。空腹一次性腹腔注射大劑量(50～70mg/kg)［1-4］的鏈脲佐菌素制備的糖尿病大鼠模型是常常被用來(lái)評(píng)價(jià)評(píng)價(jià)降糖藥物藥效的手段?？疾焯悄虿?dòng)物成模的指標(biāo)一般以空腹血糖值為依據(jù)，然而該模型對(duì)藥物的吸收、分布、代謝和排泄過程是否和糖尿病病人一致少有報(bào)道。我們通過比較Niopas等［5］報(bào)道的健康受試者與Coppack等［6］報(bào)道的II型糖尿病患者口服格列本脲藥動(dòng)學(xué)參數(shù)后發(fā)現(xiàn)，健康受試者和糖尿病人格列本脲的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)無(wú)明顯變化，這意味著格列本脲在健康受試者與II型糖尿病病人(無(wú)腎病)的體內(nèi)過程無(wú)差異。本實(shí)驗(yàn)試圖比較格列本脲在正常大鼠和一次性腹腔注射60mg/kg鏈脲佐菌素誘發(fā)糖尿病大鼠模型的藥動(dòng)學(xué)是否存在差異，并與文獻(xiàn)健康受試者和糖尿病人藥動(dòng)學(xué)相比，研究此模型與II型糖尿病病人的藥動(dòng)學(xué)是否一致，從而為確定鏈脲佐菌素誘發(fā)糖尿病大鼠模型是否適合作為藥物的評(píng)價(jià)模型提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 儀器

島津LC-20AT二元梯度泵，SPD-M20A二級(jí)陣列檢測(cè)器，DGU-20A在線脫氣系統(tǒng)，SL-20A自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)，CTO-20A柱溫箱，LC Solution色譜工作站(島津，日本)；SHZ-III型循環(huán)真空水泵(上海亞榮生化儀器廠)，高速離心機(jī)(深圳國(guó)華儀器廠)，XW-80A漩渦混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)，LT-224S電子天平(北京賽多利斯)。

1.2 藥品與試劑

鏈脲佐菌素(Sigma公司，批號(hào)：18883-66-4)，格列本脲對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：10135-0103)，地西泮對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：1230-960)，格列本脲片(山西云鵬制藥有限公司，批號(hào)：A081001)，甲醇(色譜純，德國(guó)默克公司)，乙腈(色譜純，山東禹王實(shí)業(yè)公司禹城化工廠)，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。去離子水(蘭州大學(xué)第一醫(yī)院自制)。

1.3 動(dòng)物

健康雄性W istar大鼠，體重200～250g，購(gòu)于甘肅省中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)SCXK(甘) 2004-0006。所有大鼠使用代謝籠單只喂養(yǎng)，自由飲水及給予標(biāo)準(zhǔn)化飼料。

1.4 方法

1.4.1 色譜條件：色譜柱：伊利特 Hypersil ODS2(4.6mm ×150mm，5μm)，流動(dòng)相：甲醇-0.2%乙酸溶液(57∶43，v/v)，流速：1m L/m in，柱溫：40℃，流檢測(cè)波長(zhǎng)：229 nm，進(jìn)樣量：20μL。

1.4.2 儲(chǔ)備液的配制：

1.4.2.1 內(nèi)標(biāo)溶液：精密稱取地西泮對(duì)照品適量置于100m L的容量瓶中，用乙腈定容至100m L，使地西泮濃度為0.205μg/mL，作為內(nèi)標(biāo)溶液。

1.4.2.2 格列本脲儲(chǔ)備液：精密稱取格列本脲對(duì)照品適量置于50m L的容量瓶中，用內(nèi)標(biāo)溶液配制成0.0852mg/m L的儲(chǔ)備液，置于4℃冰箱中保存，使用時(shí)用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋至所需濃度。

1.4.3 血漿樣品處理：取血漿樣品100μL，加內(nèi)標(biāo)溶液200μL，旋渦振蕩2min，3500r/min離心10m in，將除蛋白后的溶液轉(zhuǎn)移至裝有30mg～50mg氯化鈉的1.5mL離心管中，渦旋振蕩1min，靜置吸取上層有機(jī)層，40℃水浴氮?dú)獯抵辽僭S，用乙腈溶解至50μL，超聲、混勻后取20μL進(jìn)樣分析。

1.4.4 色譜行為：在上述色譜條件下，格列本脲的保留時(shí)間為 12.55min，內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間為 8.57 m in。內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾格列本脲與內(nèi)標(biāo)的分離測(cè)定。圖1為空白血樣、加樣血漿及含內(nèi)標(biāo)的血漿樣品色譜圖。

圖1 HPLC色譜圖A-空白血漿；B-空白血漿+格列本脲標(biāo)準(zhǔn)品 +內(nèi)標(biāo)；C-正常大鼠灌胃給予10mg/kg后120min的血漿樣品；D-糖尿病大鼠灌胃給予10mg/kg后120min的血漿樣品；(1為內(nèi)標(biāo)，2為格列本脲)Fig.1 HPLC chromatograms of blood plasma of the ratsNote：A：Blank plasma；B：Blank plasma spiked with glibenclamide and internal standard；C：Nomal rat plasma collected at two hours after intragastrically administration of glibenclamide 10mg/kg；D：Diabetic rat plasma taken at two hours after intragastrically administration of glibenclam ide 10mg/kg；(1：internal standard；2：glibenclamide)

1.4.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備和最低檢測(cè)濃度：精密吸取格列本脲對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋至15.62、31.25、62.50、125.00、500.00、1000.00、1 500.00μg/L的系列對(duì)照品溶液。取上述對(duì)照品溶液200μL與100μL空白大鼠血漿混合按血漿樣品處理1.4.3項(xiàng)下操作，進(jìn)樣分析。記錄格列本脲和內(nèi)標(biāo)峰面積。以格列本脲與內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo)(Y)，格列本脲的濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸，回歸得方程為：Y=3.8771X+0.0378，r2= 0.9993。表明格列本脲在 15.62μg/L～1500.00μg/L范圍內(nèi)，濃度與峰面積的線性關(guān)系良好。檢測(cè)限(S/N≥3)為3μg/L，血漿中格列本脲定量限(S/N≥10)為8μg/L。

1.4.6 精密度：配制高、中、低3種濃度(1000.00、125.00、31.25μg/L)三個(gè)不同濃度的格列本脲標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控樣品，按血漿樣品處理1.4.3項(xiàng)下操作，進(jìn)行色譜分析，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算格列本脲濃度。一日內(nèi)測(cè)定5次及每日測(cè)定1次，連續(xù)5d，計(jì)算日內(nèi)日間精密度。日內(nèi)精密度分別為3.72%，3.31%，4.58%。日間精密度分別為5.47%，9.12%，8.48%。

1.4.7 回收率：配制高、中、低(1000.00、125.00、31.25μg/L)三個(gè)不同濃度的格列本脲標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控樣品，按血漿樣品處理1.4.3項(xiàng)下操作，進(jìn)行色譜分析，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算格列本脲濃度。將實(shí)測(cè)值與理論值相比得到相對(duì)回收率，高、中、低濃度的格列本脲在大鼠血漿中的平均回收率分別為(95.73±6.17)%、(102.58±4.55)%、(93.23± 3.07)%。

1.5 藥動(dòng)學(xué)研究

1.5.1 造模及采集血樣：健康雄性W istar大鼠13只，(200～250)g，隨機(jī)分為兩組，即正常組5只和糖尿病組8只。糖尿病組大鼠禁食16h后腹腔注射鏈脲佐菌素60mg/kg。72h后斷尾取空腹血，葡萄糖氧化酶法測(cè)定空腹血糖。將空腹血糖高于16.7 mmol/L的大鼠視為造模成功，取5只納入實(shí)驗(yàn)。給藥前禁食12h，自由飲水，灌胃給予格列本脲混懸液10mg/kg。于給藥前及給藥后15、30、60、90、120、150、180、240、360、540、720min，經(jīng)股動(dòng)脈插管采血0.25m L，同時(shí)補(bǔ)充等量含40IU/m L肝素鈉的生理鹽水，血樣立刻轉(zhuǎn)入涂過肝素鈉的1.5mL離心管中，在3500r/m in離心5m in得血漿，取血漿100μL在血漿樣品處理1.4.3項(xiàng)下操作，測(cè)定血藥濃度。

1.5.2 數(shù)據(jù)處理

血藥濃度測(cè)定結(jié)果用 Drug and Statistics of Windows 2.0(DAS 2.0)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。正常組與模型組比較采取 t檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥時(shí)曲線及與藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

圖2為格列本脲在正常組和模型組的藥-時(shí)曲線圖。由圖可以看出，糖尿病大鼠組格列本脲的血藥濃度高于正常大鼠組，且達(dá)峰時(shí)間延長(zhǎng)。

圖2 灌胃給予格列本脲10mg/kg正常大鼠和糖尿病大鼠血藥濃度-時(shí)間曲線(±s，n=5)Fig.2 Mean plasma concentration-time curves of glibenclamide after intragastrically administrationin a dose of 10mg/kg in normal rats and diabetic rats(±s，n=5)

對(duì)藥時(shí)曲線中的數(shù)據(jù)用 DAS 2.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，擬合后符合權(quán)重因子為1/CC的一室模型，主要的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表1。

3 討論

一次性大劑量注射鏈脲佐菌素制備的糖尿病大鼠模型常被用來(lái)研究藥物在糖尿病狀態(tài)下的藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)［1，4，7-9］。武開明［7］采用一次性腹腔注射65mg/kg鏈脲佐菌素制備糖尿病大鼠模型，并比較了小檗堿在正常和糖尿病大鼠的藥動(dòng)學(xué)，其結(jié)果表明，在糖尿病大鼠體內(nèi)，小檗堿的Cmax和AUC(0～24h)與正常大鼠相比分別提高了1.3倍(P＜0.05)和1.5倍(P＜0.05)。劉曉等［8］采用相同方法制備糖尿病大鼠模型，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)蘆丁在糖尿病腎病大鼠體內(nèi)的AUC(0-t)與正常大鼠相比顯著增大(P＜0.01)，血漿清除率顯著減小(P＜0.05)。為了考察糖尿病對(duì)二甲雙胍藥動(dòng)學(xué)的影響，本實(shí)驗(yàn)室秦紅巖等人［10］采用空腹一次性腹腔注射60mg/kg鏈脲佐菌素制備糖尿病大鼠模型，結(jié)果表明鹽酸二甲雙胍在糖尿病大鼠體內(nèi)的Cmax、Tmax、t1/2及 AUC均顯著高于正常大鼠(P＜0.01)，其CL/F顯著低于正常大鼠(P＜0.01)。本課題結(jié)果表明格列本脲在正常大鼠和鏈脲佐菌素制備的糖尿病模型體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)存在顯著性差異。可見鏈脲佐菌素制得的糖尿病大鼠模型對(duì)藥物的藥動(dòng)學(xué)有較為顯著的影響。

表1 正常大鼠組和糖尿病大鼠組格列本脲主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(±s，n=5)Tab.1 Pharmacokinetic parameters of glibenclamide in the normal and diabetic rats(±s，n=5)

表1 正常大鼠組和糖尿病大鼠組格列本脲主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(±s，n=5)Tab.1 Pharmacokinetic parameters of glibenclamide in the normal and diabetic rats(±s，n=5)

注：Cmax，達(dá)峰血藥濃度；Tmax，血藥濃度達(dá)峰時(shí)間；CL，清除率；AUC(0～720min)，藥時(shí)曲線下面積。與正常組相比，*P＜0.05Note：Cmax：peak p lasma concentration；Tmax：time to reach Cmax；CL：total body clearance；AUC(0～720min)， area under the plasma concentration-time curve from time 0to 720min.Compared with the normal rats，*P＜0.05

參數(shù)Parameters正常大鼠組Normal rats糖尿病大鼠組Diabetic rats Tmax(min) 84.784±15.961 255.427±23.795* Cmax(μg/m L) 0.259±0.031 0.910±0.142* CL(L/min/kg) 0.092±0.012 0.019±0.008* AUC(0～720min)(mg/L·min) 57.752±18.932 321.24±130.374*

但是，Sambol等［11］比較了鹽酸二甲雙胍在健康受試者與II型糖尿病患者(無(wú)腎病)體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)，結(jié)果顯示健康受試者與糖尿病患者的所有藥動(dòng)學(xué)參數(shù)無(wú)顯著差異。Niopas等［5］報(bào)道了健康受試者口服5mg/kg格列本脲的部分藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，如下：Tmax為 3.6 ±2.3 h，Cmax為167 ±63.4 ng/m L，AUC(0-24h)為808.6±279.4ng·h/m L。Coppack等［6］報(bào)道了II型糖尿病病人(無(wú)腎病無(wú)肝病)口服5mg/kg格列本脲的部分藥動(dòng)學(xué)參數(shù)：Tmax為2.71±0.44h，Cmax為152±26ng/m L，AUC(0-24h)為1154±351ng·h/m L。通過比較兩組數(shù)據(jù)，格列本脲在健康受試者和II型糖尿病病人體內(nèi)藥的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)也無(wú)顯著性差異。因此，藥物在一次性大劑量注射鏈脲佐菌素制得的糖尿病大鼠模型體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)變化和糖尿病患者體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)的變化存在差異。

造成降糖藥物在糖尿病模型大鼠與正常大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)存在差異而在 II型糖尿病病人和健康受試者體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)無(wú)差異的原因，可能是由于一次性大劑量注射鏈脲佐菌素制備的糖尿病大鼠模型的病理機(jī)制與 II型糖尿病患者病理機(jī)制不同。鏈脲佐菌素能直接破壞胰島素β細(xì)胞，引發(fā)糖尿病癥狀，同時(shí)引起臟器損害，但其作用機(jī)制尚不明確［12］。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠胃排空減慢［13］可以導(dǎo)致格列本脲的吸收增加，從而使其AUC顯著增加。鏈脲佐菌素及高血糖環(huán)境能造成肝臟病變以及引起肝臟代謝酶的變化［14-15］。此外鏈脲佐菌素具有腎毒性，可抑制腎臟細(xì)胞的增殖和凋亡，引起細(xì)胞肥大，最終導(dǎo)致糖尿病腎?。?6-17］，引起體內(nèi)藥物蓄積。體內(nèi)肝臟及腎臟的損傷使格列本脲在糖尿病大鼠體內(nèi)的總清除率下降。

因此，鏈脲佐菌素制得的糖尿病大鼠模型可能不完全符合II型糖尿病的病理狀態(tài)。由本實(shí)驗(yàn)室及他人的研究數(shù)據(jù)表明，鏈脲佐菌素制備的糖尿病大鼠模型導(dǎo)致藥物的體內(nèi)過程與正常大鼠明顯不同，與臨床實(shí)際情況出入較大，從而可能不適用于考察藥物在II型糖尿病病態(tài)下的藥動(dòng)學(xué)研究。

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