覃 亮， 路 寬， 董 基， 楊小霞

(1.肇慶學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，廣東肇慶526061;2.肇慶市水產(chǎn)技術(shù)推廣中心，廣東肇慶526060)

紅樹植物桐花樹Aegiceras corniculatum，紫金牛科，生長(zhǎng)在海陸交界的潮間帶地區(qū)，其多糖的組成與生物活性可能與陸生植物和海洋植物有著較大的差異［1］。多糖類化合物在自然界分布極廣，廣泛存在于動(dòng)植物中，經(jīng)研究部分多糖具有抗腫瘤和增強(qiáng)免疫的藥理作用［2］。本實(shí)驗(yàn)通過提取和分離桐花樹多糖組分，并對(duì)其抑菌能力進(jìn)行研究，為促進(jìn)桐花樹的研究和開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

桐花樹，采自湛江東海島。大腸桿菌Escherichia coli、枯草芽抱桿菌 Bacillus subtilis、黑曲霉菌 Aspergillus mold、綠霉菌Trichoderma riride，肇慶學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院食品工程實(shí)驗(yàn)室提供。

纖維素DE-52，北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司;Sephadex G-200，Pharmacia公司，其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為蒸餾水。

UV/VIS 916型紫外分光光度計(jì)，澳大利亞GBC公司;真空干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;LRH-150細(xì)菌培養(yǎng)箱，海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司;MJX-250B-Z型霉菌培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;SW-CJ-IF型凈化工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 桐花樹多糖的提?。?］桐花樹粉碎至能通過40目篩，脫脂，揮干溶劑后用熱水浸提。浸提液濃縮至原來體積的1/3，加3倍其體積的95%乙醇，5℃醇析過夜，離心15 min，去上清液;所得沉淀依次用無水乙醇、丙酮、無水乙醚各洗滌3次，離心5 min，收集沉淀，真空干燥，即得桐花樹粗多糖。

2.2 桐花樹多糖的純化 利用DEAE-52纖維素柱層析依次用蒸餾水、0.05 mol/L NaCl、0.2 mol/L NaCl，0.4 mol/L NaCl和0.1 mol/L NaOH溶液洗脫，分部收集器進(jìn)行收集，每管收集5 mL，用苯酚-硫酸法跟蹤檢測(cè)，合并單一峰，濃縮、透析、真空冷凍干燥。

利用Sephadex G-200柱層析對(duì)DEAE-52纖維素柱層析得到的較大組分進(jìn)行進(jìn)一步純化。洗脫液為0.2 mol/L NaCl，分部收集器進(jìn)行收集，每管收集3 mL，用苯酚-硫酸法跟蹤檢測(cè)，合并收集主峰部位，濃縮、干燥得到兩個(gè)桐花樹多糖純品桐花樹多糖-Ⅰ、桐花樹多糖-Ⅱ。

2.3 桐花樹多糖的抑菌實(shí)驗(yàn) 選取大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉菌、綠霉菌4種食品常見微生物對(duì)桐花樹多糖進(jìn)行抑菌性實(shí)驗(yàn)，確定出所抑菌的種類和最低抑菌濃度(MIC)。

2.3.1 培養(yǎng)基制備 細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，霉菌用馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基［4］。

2.3.2 供試菌種的活化及菌懸液的制備 在對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基上活化實(shí)驗(yàn)所需的供試菌種，細(xì)菌置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，真菌置28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。分別挑取一環(huán)已活化好的菌種放入無菌生理鹽水中，10倍梯度稀釋，制成濃度為107～108cfu/mL的菌懸液備用［5-6］。

2.3.3 桐花樹多糖溶液的配制 準(zhǔn)確稱取100 mg桐花樹多糖，用無菌水溶解，配成8 mg/mL的多糖溶液，用2倍稀釋法配制成4、2、1、0.5 mg/mL不同質(zhì)量濃度的多糖溶液，備用［7］。

2.3.4 桐花樹多糖的抑菌作用測(cè)定［8］采用濾紙片法［9-10］測(cè)定桐花樹多糖對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉菌、綠霉菌4種受試菌的抑制作用。將直徑為9 mm的圓形濾紙片，滅菌后取數(shù)片分別放入桐花樹多糖溶液 (8 mg/mL)、無菌生理鹽水、6%苯甲酸鈉溶液中浸泡30 min，取出在無菌條件下風(fēng)干。分別取浸有供試液、6%苯甲酸鈉溶液及無菌生理鹽水的濾紙片各3片間隔一定距離貼在涂布好的含菌平板上，置于適宜溫度下進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)量其抑菌圈直徑，比較抑菌效果［11］。

2.3.5 最小抑菌濃度 (MIC)的測(cè)定［12-13］選取桐花樹多糖抑菌效果較好的菌種為供試菌種，以2.3.3項(xiàng)配好的不同質(zhì)量濃度的桐花樹多糖溶液為供試液，采用濾紙片法測(cè)定不同質(zhì)量濃度供試液的抑菌圈，以出現(xiàn)抑菌圈的最低質(zhì)量濃度為最小抑菌濃度 (MIC)。

3 結(jié)果與討論

3.1 桐花樹多糖的提取 桐花樹多糖提取率為25.32%。

3.2 桐花樹多糖DEAE-52纖維素柱層析結(jié)果 見圖1。

圖1 DEAE-52纖維素柱層析分離結(jié)果

由圖1可知，桐花樹多糖經(jīng)DEAE-52纖維素柱洗脫后得到兩個(gè)洗脫峰桐花樹多糖-Ⅰ (蒸餾水)、桐花樹多糖-Ⅱ(0.4 mol/L NaCl)，各組分經(jīng)減壓濃縮，透析，冷凍干燥后，得率分別為5.45%、43.11%。

3.3 桐花樹多糖經(jīng)Sephadex G-200柱層析結(jié)果 利用Sephadex G-200柱層析對(duì)DEAF-52柱層析得到的兩個(gè)較大組分桐花樹多糖-Ⅰ、桐花樹多糖-Ⅱ進(jìn)一步純化的結(jié)果見圖2和圖3。由圖可知，DEAE-52纖維素柱的兩個(gè)洗脫峰經(jīng)Sephadex G-200柱層析后均得到單一峰，表明純化后的桐花樹多糖為單一組分多糖。

圖2 桐花樹多糖-Ⅰ的Sephadex G-200柱層析洗脫曲線

圖3 桐花樹多糖-Ⅱ的Sephadex G-200柱層析洗脫曲線

3.4 桐花樹多糖抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.4.1 桐花樹多糖對(duì)4種微生物的抑制作用 桐花樹多糖對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉菌、綠霉菌4種食品常見微生物的抑制作用效果見表1。桐花樹多糖在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度 (8 mg/mL)時(shí)，對(duì)綠霉菌均無抑制作用，而對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉菌有選擇性抑制作用，抑菌圈直徑越大，說明抑菌效果越好。

表1 桐花樹多糖對(duì)4種不同微生物的抑制作用 (n=3)

3.4.2 桐花樹多糖的最小抑菌濃度 (MIC) 以大腸桿菌、枯草芽抱桿菌，黑曲霉菌為供試菌，利用濾紙片法測(cè)定桐花樹多糖、桐花樹多糖-Ⅰ、桐花樹多糖-Ⅱ的最小抑菌濃度。由表2，表3，表4可以看出，不同多糖出現(xiàn)抑菌圈的最低質(zhì)量濃度各不相同。桐花樹多糖、桐花樹多糖-Ⅰ、桐花樹多糖-Ⅱ?qū)Υ竽c桿菌的MIC值為2 mg/mL、1 mg/mL、4 mg/mL，桐花樹多糖、桐花樹多糖-Ⅰ對(duì)枯草芽孢桿菌的MIC值為2 mg/mL與4 mg/mL，桐花樹多糖、桐花樹多糖-Ⅱ?qū)Υ竽c桿菌、黑曲霉菌有抑菌作用的MIC值為4 mg/mL與8 mg/mL。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)桐花樹多糖的提取和抑菌活性作了初步的研究，通過用Sephadex G-200柱和DEAE-52纖維素柱分離出兩種純度較高的多糖桐花樹多糖-Ⅰ、桐花樹多糖-Ⅱ。抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，桐花樹多糖具有一定的抑菌活性，對(duì)所抑菌的種類具有選擇性，桐花樹多糖對(duì)綠霉菌無抑制作用，桐花樹多糖-Ⅰ對(duì)黑曲霉菌、綠霉菌無抑制作用，桐花樹多糖-Ⅱ?qū)莶菝咕⒕G霉菌無抑制作用。桐花樹多糖和分離出來的多糖組分桐花樹多糖-Ⅰ、桐花樹多糖-Ⅱ表現(xiàn)出來的抑菌能力也不相同，并不是單純的抑菌能力疊加關(guān)系，這可能與粗多糖中存在其他抑菌成分有關(guān)。本研究結(jié)果具有一定的理論和應(yīng)用價(jià)值，為桐花樹在食品和醫(yī)藥防腐領(lǐng)域的應(yīng)用提供了研究基礎(chǔ)。

表2 桐花樹多糖對(duì)大腸桿菌的抑菌效果 (n=3)

表3 桐花樹多糖對(duì)枯草芽抱桿菌的抑菌效果 (n=3)

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