李 慧， 許 亮， 徐保利， 管慧潔， 何 華， 王 冰

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧大連116600)

地錦草為大戟科植物地錦Euphorbia humifusa Willd．或斑地錦 Euphorbia maculata L．的干燥全草。具有清熱解毒、涼血止血、利濕退黃的功效。常用于治療痢疾、腸炎、咳血、便血、崩漏、瘡疥癰腫，濕熱黃疸等［1］。藥理研究表明地錦草的抗菌抗炎作用明顯，止血作用效果好，有很強的清除和抑制自由基的作用，是一種較強的抗氧化植物，而且對·OH引發(fā)的DNA氧化損傷有一定的保護作用［2］。

通奶草，千根草和大地錦是同科屬植物通奶草Euphorbia hypericifolia Linn．，千根草Euphorbia thymifolia Linn．和大地錦 Euphorbia nutans Lagasca．的干燥全草。據(jù)文獻報道通奶草全草入藥，微酸、澀，微涼，通奶故得名［3］。千根草全草入藥，有清熱利濕、收斂止癢的作用，主治菌痢、腸炎、腹瀉等［3］。

地錦草主要含有黃酮類、酚酸類化學(xué)成分，其鮮汁、水煎劑、醇提液均有抗菌作用。其中黃酮類化合物是地錦草抗菌、止血、抗氧化的主要有效成分。沒食子酸具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒等生物學(xué)活性;槲皮素、山柰素等黃酮類化合物是地錦草抗菌、止血、抗氧化的主要有效成分。黃酮類及酚酸類的含有量高低影響著藥材的療效。為了了解地錦草及其3種同科屬植物中總黃酮及此3種指標(biāo)性成分的含有量區(qū)別，本實驗對5個不同種的地錦類藥材進行總黃酮和3個酚酸類化合物的定量測定并對其進行數(shù)據(jù)分析，為地錦類藥材的質(zhì)量評價和開發(fā)藥材資源、鑒定藥用植物真?zhèn)蔚於嘶A(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 藥物

藥材均為采集樣品，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室王冰教授鑒定為地錦Euphorbia humifusa Willd．，斑地錦 Euphorbia maculata Linn．，通奶草Euphorbia hypericifolia Linn．，大地錦 Euphorbia nutans Lagasca．和千根草 Euphorbia thymifolia Linn．的干燥全草。

1.2 儀器與試劑

UV3010紫外分光光度計 (日本日立公司)，Agilent 1100高效液相色譜儀、VWD檢測器(G1314A)、四元泵 (G1311A)(美國Agilent公司)，電子天平 (瑞士 Mettler Toledo AG285、AE240)，KQ3200B型超聲波清洗儀 (昆山超聲儀器有限公司)。

沒食子酸、槲皮素、山柰素、蘆丁對照品 (貴州迪大生物技術(shù)公司，純度≥98%)。石油醚、甲醇、乙醇 (科密歐試劑有限公司)，重蒸餾水，鹽酸、磷酸。除色譜甲醇實驗所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 5種地錦藥材總黃酮的測定

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對照品28.0 mg，置50 mL量瓶中，加60%乙醇至刻度，混勻，作為對照品溶液 (蘆丁質(zhì)量濃度為0.56 mg/mL)。

2.1.2 供試品溶液的制備 取樣品粉末 (過60目篩)2 g，精密稱定，置索氏提取器中，加石油醚(60～90℃)回流脫至無色，棄去醚液，藥渣揮至無醚味，加20倍60%乙醇稱定質(zhì)量，超聲提取，每次1.5 h提取3次，每次提取后稱定質(zhì)量，用60%乙醇補足損失的質(zhì)量，混勻，過濾，合并濾液，蒸干，用60%乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，加60%乙醇至刻度。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 分別移取上述配制好的蘆丁對照液 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于7只規(guī)格相同的25 mL量瓶中，加60%乙醇至6.0 mL，依次加入5%亞硝酸鈉試液1.0 mL，放置6 min，10%硝酸鋁試液1.0 mL，放置6 min，10%氫氧化鈉試液10.0 mL，加60%乙醇至刻度，混勻，放置15 min后，以相應(yīng)試劑做空白，于510 nm處測定吸光度，以對照品質(zhì)量濃度 (C)與吸光度(A)進行直線回歸，得回歸方程:Y=4.980 1X+0.003 8(r=0.999 9)，在0.022 4～0.134 4 mg/mL內(nèi)呈良好的線性。

2.1.4 最大吸收波長及穩(wěn)定性考察 精密量取蘆丁對照品液和樣品液各12.5 mL分別置于25 mL量瓶中，依次加入5%亞硝酸鈉試液1.0 mL，放置6 min，10%硝酸鋁試液1.0 mL，放置6 min，10%氫氧化鈉試液10.0 mL，加60%乙醇至刻度，混勻，放置15 min后，以相應(yīng)試劑做空白，于UV3010紫外分光光度計上進行全波長掃描，最大吸收波長為510 nm，同時在510 nm波長處進行時間掃描，平均吸光度為0.2754和0.3356，RSD為0.25%和0.28%顯示150 min內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.5 精密度實驗 精密吸取對照品溶液5 mL，置于25 mL量瓶中，依次加入5%亞硝酸鈉試液1.0 mL，放置6 min，加10%硝酸鋁試液1.0 mL，放置6 min，加10%氫氧化鈉試液10.0 mL，加60%乙醇至刻度，搖勻，放置15 min后，以相應(yīng)試劑做空白，在510 nm處測定吸光度7次，計算供試品溶液中總黃酮。平均吸光度為0.2756，RSD為0.25%。顯示實驗精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性實驗 按2.1.2項方法制備供試品溶液，按2.1.3項方法顯色，平行做7份。于510 nm處測定其吸光度，并計算其總黃酮。其平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.66 mg/g，RSD為0.28%。重復(fù)性良好。

2.1.7 加樣回收率 取6號粉末 (過60目篩)7份，每份精重稱定2 g，分別添加9.20 mg蘆丁對照品，按2.1.2項下供試品溶液制備方法制備并按2.1.3項顯色并測定。平均加樣回收率為100.52%，RSD為0.33%。

2.1.8 樣品測定 按2.1.2項方法制備供試品溶液，按2.1.3項方法顯色。于510 nm處測定其吸光度，并計算其總黃酮含有量。

2.2 5種地錦類植物中沒食子酸、槲皮素及山柰素的測定

2.2.1 對照品溶液的制備 分別取沒食子酸、槲皮素和山柰素對照品，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.518 mg/mL、0.702 mg/mL、0.408 mg/mL的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 稱取各編號粉末 (過60目篩)3.0 g，精密稱定，置250 mL圓底燒瓶中，精密加入80%甲醇100 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1.5 h，放冷，稱定質(zhì)量，用80%甲醇補足減失的質(zhì)量，混勻，濾過，精密量取續(xù)濾液40 mL，精密加入25%鹽酸溶液14 mL，置85℃水浴中水解30 min，取出，迅速冷卻，轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，混勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 色譜條件 Agilent TC-C18色譜柱 (150 mm×4.6 mm，5 μm);流動相為甲醇－0.4%磷酸水系統(tǒng)，使用前超聲脫氣30 min，采用梯度洗脫，0～13 min，2%甲醇，13～14 min，52%甲醇，14～30 min，52%甲醇;體積流量1 mL/min;柱溫30℃，檢測波長0～12.5 min，270 nm，12.5～30 min，360 nm。

2.2.4 方法專屬性 將沒食子酸、槲皮素和山柰素對照品混合溶液和制備的供試品溶液分別進樣10 μL分析，見圖1?？梢姏]食子酸、槲皮素和山柰素峰達到基線分離，無雜質(zhì)干擾。理論塔板數(shù)按槲皮素、山柰素和沒食子酸計算均不低于20 000。

2.2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取上述對照品溶液，在選擇的色譜條件下分別進樣，沒食子酸Y=2 830.3X+2.357 1，r=0.999 8(n=6)，線性范圍0.051 8～0.621 6 μg;槲皮素 Y=2 997.3X－22.906，r=0.999 8(n=6)，線性范圍0.070 2～0.702 0 μg;山柰素 Y=3 260.8X －27.26，r=0.999 9(n=6)，線性范圍0.020 4 ～0.408 0 μg。

2.2.6 精密度試驗 吸取對照品溶液5 μL，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，結(jié)果沒食子酸、槲皮素和山柰素峰面積的RSD分別為1.96%、2.09%、2.84%。

圖1 對照品 (A)和樣品 (B)色譜圖Fig.1 HPLC Chromatograms of reference substances(A)and the sample(B)

2.2.7 穩(wěn)定性考察 取同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12 h進樣，記錄峰面積，結(jié)果沒食子酸、槲皮素和山柰素峰面積的RSD分別為1.96% 、2.86%、1.41%。表明供試品溶液在0～12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗 取同批藥材6份，精密稱定，按2.2.2項下供試品溶液制備方法制備并測定，RSD分別為2.17%、2.85%、1.50%。

2.2.8 加樣回收率試驗 取5號地錦草粉末6份，每份約3.0 g，精密稱定，分別添加沒食子酸、槲皮素、山柰素對照品2.590 mg、3.510 mg、2.040 mg，按2.2.2項下供試品溶液制備方法制備并測定，計算。沒食子酸、槲皮素、山柰素的平均回收率 (RSD)分別為102.17%(2.83%)、97.80%(2.42%)和98.02%(2.72%)。見表1～3。

表1 沒食子酸加樣回收率Tab.1 Recovery of gallic acid

2.2.9 樣品測定 精密吸取對照品溶液與地錦草供試品溶液10 μL，按上述色譜條件測定，并計算沒食子酸、槲皮素和山柰素的含有量。結(jié)果見表4。

表3 山柰素加樣回收率Tab.3 Recovery of kaempferol

表2 槲皮素加樣回收率Tab.2 Recovery of quercetin

表4 測定結(jié)果Tab.4 Results of the determination(n=2)

3 結(jié)果與討論

以3種酚酸類成分和總黃酮含有量為指標(biāo)，利用spss15.0統(tǒng)計軟件進行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果見圖2。根據(jù)實驗結(jié)果將5種地錦類植物分為四個類別:千根草為一類，地錦和斑地錦為一類，通奶草和18、20、21號大地錦為一類，19號大地錦為一類。初步將地錦草正品藥材和其他3種地錦類植物區(qū)分開。

由于品種、采集地點、采集時間等是影響總黃酮的重要因素，故本實驗用紫外分光光度法對地錦類藥材中總黃酮進行了檢測。實驗結(jié)果提示總黃酮含有量順序為通奶草＞大地錦＞地錦＞斑地錦＞千根草。由此可以看出，大地錦和通奶草的總黃酮含有量明顯高于兩個地錦草的正品來源，即地錦和斑地錦。為地錦草藥材的新藥源的開發(fā)提供了理論依據(jù)。

圖2 聚類分析Fig.2 Cluster analysis

根據(jù)文獻報道地錦草中酚酸類化合物大多以糖苷的形式存在，主要為槲皮素及苷、山柰素及苷等。直接測定地錦草藥材中沒食子酸、槲皮素、山柰素，發(fā)現(xiàn)其含有量很低，直接測定可能難以準(zhǔn)確反映其中黃酮的實際含量，因此本實驗采取酸水解后測定其沒食子酸、槲皮素和山柰素，獲得較為滿意的效果。

對于水解條件的選擇，采用的2010年版《中華人民共和國藥典》的水解條件，鹽酸濃度不宜過高，酸性太強對進樣閥和色譜柱的腐蝕作用較大。色譜條件摸索時，發(fā)現(xiàn)流動相的pH值對色譜峰的峰形及分離度影響很大，比較甲醇-不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的磷酸溶液等多種溶劑系統(tǒng)，確定流動相為甲醇－0.4%磷酸 (V/V)梯度洗脫，得到的色譜峰峰形尖銳，分離度高，且基線較穩(wěn)定［4-11］。

系統(tǒng)聚類分析是一種無管理、無指導(dǎo)的模式識別方法，可依賴所測樣品的數(shù)據(jù)，對樣品進行分類。本實驗是根據(jù)3種酚酸成分和其總黃酮的含有量作為指標(biāo)進行聚類分析。3種酚酸成分和其總黃酮測定結(jié)果顯示，5種地錦類植物之間的3種酚酸類成分和總黃酮含有量差異較大，因此不能根據(jù)某一成分含有量的高低來評價其質(zhì)量的好壞，所以本實驗采用系統(tǒng)聚類分析法以3種酚酸類成分和總黃酮含有量作為綜合指標(biāo)對這5種地錦類植物進行了質(zhì)量評價方法研究，根據(jù)實驗結(jié)果在不考慮地錦草的生長環(huán)境及采收時間對其成分的影響的情況將5種地錦類植物分為四個類別。

本實驗使用高效液相色譜法對地錦草的沒食子酸、槲皮素和山奈素進行測定，使用統(tǒng)計軟件對其各指標(biāo)性成分及總黃酮含有量進行聚類分析并且得到較好的結(jié)果。對根據(jù)多指標(biāo)成分應(yīng)用系統(tǒng)聚類分析來判斷中藥材質(zhì)量的方法進行了有益的嘗試，初步將地錦草正品藥材和其他三種地錦類植物區(qū)分開。為地錦類植物的質(zhì)量評價和開發(fā)藥材資源，鑒定藥用植物真?zhèn)翁峁┝思夹g(shù)支持和科學(xué)依據(jù)。

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