崔春利， 王繼濤， 王 敏， 劉文中， 唐志書(shū)， 郭東艷

(1.陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西咸陽(yáng)712046;2.陜西中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，陜西咸陽(yáng)712000;3.浙江工業(yè)大學(xué)，浙江杭州310014)

茱苓草，系龍膽科龍膽屬植物秦嶺龍膽Gentiana apiata N．E．Br．的全草，為秦巴山區(qū)特有的藥用植物資源，其味苦，性平，入肝、大腸、膀胱三經(jīng)，具有調(diào)經(jīng)活血，清熱明目，利小便之功，用于治療頭昏、失眠、小便不利、淋癥、月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)、崩漏、白帶、痢疾、腹痛等［1］。其主要化學(xué)成分有萜類(lèi)，黃酮類(lèi)，三萜，糖類(lèi)及谷甾醇類(lèi)等［2-3］，其中環(huán)烯醚萜和裂環(huán)環(huán)烯醚萜類(lèi)為龍膽屬植物特征性成分，大多具有較強(qiáng)生理活性:馬錢(qián)苷酸有提高皮膚機(jī)能、促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)、抑制中樞神經(jīng)、鎮(zhèn)痛和抗炎等作用;龍膽苦苷有促進(jìn)胃液分泌、抗原蟲(chóng)和抗炎作用［4］。目前對(duì)于茱苓草的文獻(xiàn)報(bào)道較少，多是化學(xué)成分的研究，但關(guān)于茱苓草定量測(cè)定尚未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合文獻(xiàn)［5-10］報(bào)道方法，建立了雙波長(zhǎng)HPLC法同時(shí)測(cè)定茱苓草中馬錢(qián)苷酸和龍膽苦苷，且對(duì)茱苓草全草和地上部分兩個(gè)部位進(jìn)行了比較，方法的準(zhǔn)確度與重復(fù)性考察均獲得較滿意的結(jié)果，適用于茱苓草中馬錢(qián)苷酸和龍膽苦苷的定量分析。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters2695高效液相色譜儀 (美國(guó)Waters公司，Empower色譜工作站，Waters 2996 DAD);UV-2550紫外可見(jiàn)分光光度儀 (日本島津);BT 25S(十萬(wàn)分之一)電子天平 (北京賽多利斯儀器有限公司);KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器 (昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 馬錢(qián)苷酸及龍膽苦苷對(duì)照品 (中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)分別為111865-201001、110770-201013;純度分別為90.9%、96.9%，供定量測(cè)定用);茱苓草全草藥材2010年7月采自太白鰲山、市售茱苓草地上部分藥材購(gòu)自太白縣藥材收購(gòu)門(mén)市部 (均由陜西中醫(yī)學(xué)院王繼濤高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為龍膽科龍膽屬植物秦嶺龍膽Gentiana apiata N．E．Br．);甲醇為色譜純，水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) Hypersil GOLD aQ C18柱 (250 mm ×4.6 mm，5 μm);以甲醇-0.1%磷酸溶液 (20∶80)為流動(dòng)相;體積流量為1 mL/min;柱溫為30℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為233 nm與272 nm。在此色譜條件下，馬錢(qián)苷酸和龍膽苦苷均與樣品中其他組分色譜峰基線分離，見(jiàn)圖1。按馬錢(qián)苷酸峰計(jì)算，理論板數(shù)為4 595，按龍膽苦苷峰計(jì)算，理論板數(shù)為9 648。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.2 對(duì)照品溶液的制備及測(cè)定波長(zhǎng)選擇 精密稱(chēng)取馬錢(qián)苷酸對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.166 mg的溶液;精密稱(chēng)取龍膽苦苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.219 mg的溶液。分別以所配制馬錢(qián)苷酸和龍膽苦苷對(duì)照品溶液為母液，經(jīng)適宜稀釋?zhuān)约状紴槿軇┛瞻?，采用UV-2550于紫外200～400 nm下進(jìn)行掃描，結(jié)果馬錢(qián)苷酸λmax=233 nm，龍膽苦苷λmax=272 nm，故采用233 nm和272 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.3 供試品溶液的制備 取本品粉末約0.24 g，精密稱(chēng)定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理 (功率100 W，頻率40 kHz)20 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò) (0.45 μm)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 線性范圍的考察 分別進(jìn)樣馬錢(qián)苷酸對(duì)照品溶液和龍膽苦苷對(duì)照品溶液 3、5、10、15、20 μL，按上述色譜條件注入色譜儀，記錄峰面積，分別以馬錢(qián)苷酸、龍膽苦苷峰面積對(duì)進(jìn)樣量 (μg)回歸，得馬錢(qián)苷酸回歸方程為:A=596 496.102 1 C－10 277.941 18，相關(guān)系數(shù)r=0.999 1，馬錢(qián)苷酸在0.498～3.32 μg線性關(guān)系良好。龍膽苦苷回歸方程為:A=1 882 505.81C－85 636.286 51，相關(guān)系數(shù) r=0.999 9，龍膽苦苷在0.657～4.38 μg線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，各5 μL，記錄峰面積，結(jié)果馬錢(qián)苷酸RSD為0.15%，龍膽苦苷RSD為0.12%，表明本試驗(yàn)儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 稱(chēng)取本品適量，按供試品制備方法制備供試液，分別于0、4、8 h進(jìn)樣5 μL測(cè)定峰面積，結(jié)果馬錢(qián)苷酸RSD為1.50%，龍膽苦苷RSD為0.75%。表明本品在8 h穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取茱苓草藥材5份，按供試品制備方法制成供試液，依法測(cè)定，馬錢(qián)苷酸的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.40%，RSD為0.69%。龍膽苦苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.92%，RSD為2.98%。結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取一定量已知含有量的樣品(馬錢(qián)苷酸與龍膽苦苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為:24.556 1 mg/g、19.688 4 mg/g)精密加入適量對(duì)照品，依法制備供試液，測(cè)定含有量并計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1和表2。

表1 馬錢(qián)苷酸的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)Tab.1 Results of recovery tests of loganic acid(n=6)

表2 龍膽苦苷的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)Tab.2 Results of recovery tests of gentiopicroside(n=6)

2.9 樣品測(cè)定 取茱苓草全草粗粉0.24 g與其地上部分粗粉3.0 g，各6批，按供試品制備方法制備樣品，依上述色譜條件測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果 (n=6)Tab.3 Results of contents determination of samples

3 討論

本研究通過(guò)紫外掃描確定馬錢(qián)苷酸λmax為233 nm，龍膽苦苷λmax為272 nm，因而采用233 nm、272 nm雙波長(zhǎng)HPLC同步檢測(cè)技術(shù)對(duì)茱苓草中馬錢(qián)苷酸與龍膽苦苷進(jìn)行測(cè)定，方法科學(xué)，又極大簡(jiǎn)化了色譜分離檢測(cè)步驟，提高了實(shí)驗(yàn)效率。一般高效液相色譜—可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器系統(tǒng)均能實(shí)現(xiàn)，具有普遍適用性。最重要是，可以克服 (固定波長(zhǎng))單波長(zhǎng)254 nm［11］同時(shí)檢測(cè)這2個(gè)成分檢測(cè)靈敏度較低的缺陷。

流動(dòng)相系統(tǒng)的選擇中，鑒于2010年版《中國(guó)藥典》一部秦艽含量測(cè)定項(xiàng)中流動(dòng)相采用乙腈-0.1%醋酸溶液［11］，考慮到系統(tǒng)0.1%醋酸溶液相對(duì)0.1%磷酸溶液有紫外本底吸收，同時(shí)鑒于醋酸具有揮發(fā)性，可隨時(shí)間造成流動(dòng)相pH緩慢改變，故最終選擇0.1%磷酸溶液作為色譜系統(tǒng)的流動(dòng)相。

從樣品測(cè)定結(jié)果，茱苓草全草與茱苓草地上部分2個(gè)藥材部位含有量差異懸殊，無(wú)論馬錢(qián)苷酸還是龍膽苦苷，推測(cè)其所含有的這2種環(huán)烯醚萜苷類(lèi)成分主要集中于其根部，提示以全草入藥為好。

與茱苓草同屬的龍膽藥材 (Gentianae Radix et Rhizoma)，系龍膽科植物龍膽 (Gentianae scabra Bge．)的根及根莖，臨床主要以其干燥根和根莖入藥。李文龍［12］對(duì)全國(guó)6個(gè)不同產(chǎn)地的龍膽藥材中龍膽苦苷和馬錢(qián)子苷酸含有量進(jìn)行了比較研究，將其結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)茱苓草含有量比較，可以看出陜西太白山特有這個(gè)種的茱苓草的全草中馬錢(qián)苷酸量高出龍膽藥材6個(gè)產(chǎn)地中任一產(chǎn)地，而龍膽苦苷含有量略低于其6個(gè)產(chǎn)地的平均值，顯而易見(jiàn)，龍膽屬這2個(gè)不同種的藥材中環(huán)烯醚萜苷成分差異明顯，提示兩者的藥理效應(yīng)可能存在差異，那么今后有待對(duì)茱苓草藥理效應(yīng)進(jìn)一步研究。

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