黃琴偉， 唐登峰， 李櫻紅， 李 正， 祝 明

(浙江省食品藥品檢驗(yàn)所，杭州浙江310004)

冠心寧注射液具有活血化瘀，通脈養(yǎng)心作用，用于冠心病心絞痛［1］。由于冠心寧注射液由丹參、川芎兩味藥組成，為中藥注射液，所含成分復(fù)雜，故其成分分析對(duì)保障臨床用藥安全起著至關(guān)重要的作用。作者曾對(duì)丹參和川芎中的水溶性成分丹參素鈉、原兒茶醛、阿魏酸、迷迭香酸和丹酚酸B等進(jìn)行定量測(cè)定，所測(cè)得的量占總固體僅為2%～3%，表明冠心寧注射液中仍有大部分成分為未知成分。查閱冠心寧注射液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［1］，制法項(xiàng)未添加果糖、葡萄糖、蔗糖等輔料。另根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［2-4］，川芎藥材中含有較多糖類(lèi)成分，丹參藥材中也含有少量的糖類(lèi)，故對(duì)冠心寧注射液的糖類(lèi)成分進(jìn)行分析有助于完善其基礎(chǔ)物質(zhì)研究，完善冠心寧注射液的質(zhì)量控制方法。本實(shí)驗(yàn)從臨床用藥安全角度出發(fā)進(jìn)而提高和完善樣品質(zhì)量控制，對(duì)冠心寧注射液中糖類(lèi)成分進(jìn)行分析測(cè)定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent1100型系列高效液相色譜儀:包括G1311A四元泵，G1322A脫氣機(jī)，G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316A柱溫箱，Alltech 2000蒸發(fā)光散射檢測(cè)器。

1.2 試藥 果糖對(duì)照品 (批號(hào):100231-200303)、D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品 (批號(hào):110833-200904)、蔗糖對(duì)照品 (批號(hào):1507-200001)均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，供含量測(cè)定用。乙腈為色譜純，水為重蒸水。共收集了6個(gè)廠家共71批樣品，樣品信息見(jiàn)表1。

吸取上述對(duì)照品貯備液3.0 mL，置10 mL量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻即得，作為線(xiàn)性溶液①。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 以糖基為填充劑 (Prevail Carbohydrate ES柱4.6 mm×250 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙腈-水 (79∶21);體積流量1.0 mL/min;ELSD檢測(cè)器;漂移管溫度100℃;N2流量2.8 L/min。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別稱(chēng)取果糖對(duì)照品、葡萄糖對(duì)照品、蔗糖對(duì)照品377.50 mg、282.05 mg及408.21 mg，置25 mL量瓶中，加水使溶解并稀釋至刻度，搖勻即得，作為對(duì)照品貯備液。

表1 71批冠心寧注射液信息Tab.1 Information of 71 batches of Guanxinning Injection

吸取上述線(xiàn)性溶液①2.0 mL，置5 mL量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻即得，作為線(xiàn)性溶液②。

另分別稱(chēng)取果糖對(duì)照品、葡萄糖對(duì)照品、蔗糖對(duì)照品249.10 mg、175.75 mg及255.56 mg，置15 mL量瓶中，加蒸餾水使溶解并定容至刻度，搖勻即得，作為對(duì)照品溶液③。

吸取對(duì)照品溶液③3.0 mL，置10 mL量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液④。

2.3 供試品溶液的制備 取冠心寧注射液2.0 mL置10 mL量瓶，加水至刻度，搖勻，作為供試品溶液。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 冠心寧注射液?jiǎn)翁?、寡糖測(cè)定對(duì)照品(A)和樣品 (B)HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances(A)and Guanxinning Injection(B)

2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密吸取一定體積的上述各對(duì)照品溶液 (線(xiàn)性溶液①1、2、5、10、15、20、25、30 μL;線(xiàn)性溶液②1、2 μL)分別注入色譜儀，以進(jìn)樣量 (μg)的對(duì)數(shù)值 (lgW)為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積的對(duì)數(shù)值 (lgA)為縱坐標(biāo) (Y)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，建立3種標(biāo)準(zhǔn)糖的線(xiàn)性回歸方程，分別為:果糖 Y=1.707 1 X+8.707 8，r=0.999 6;葡萄糖 Y=1.762 9 X+7.323 2，r=0.999 7;蔗糖 Y=1.672 3 X+8.253 9，r=0.998 7。結(jié)果表明:果糖、葡萄糖、蔗糖分別在1.812 ～45.300 μg、1.354 ～ 101.538 μg、1.959 ～146.956 μg范圍內(nèi)呈良好的對(duì)數(shù)線(xiàn)性關(guān)系。

2.5 精密度考察 取同一份供試品溶液 (批號(hào):091108)，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，果糖、葡萄糖、蔗糖的RSD分別為0.2%、0.3%、0.2%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液 (批號(hào):091108)，分別在 0、4、8、12、16、21、26 h時(shí)注入色譜儀，記錄果糖、葡萄糖、蔗糖峰面積，考察樣品的穩(wěn)定性，試驗(yàn)結(jié)果果糖、葡萄糖、蔗糖的RSD分別為0.1%、0.2%、0.2%，表明被測(cè)溶液在26 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 按供試品溶液制備方法，取同一批樣品 (批號(hào)091108)共6份，注入液相色譜儀，依法測(cè)定。結(jié)果表明，冠心寧注射液中果糖、葡萄糖、蔗糖及總糖質(zhì)量濃度分別為32.584、24.225、35.140 mg/mL及91.949 mg/mL，其RSD分別為0.21%、0.37%、0.18%及0.23%。

2.8 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取同一批樣品 (批號(hào)091108)各1.0 mL，共9份，每3份為一個(gè)水平，分別精密加入對(duì)照品溶液③1.0、2.0、3.0 mL，按2.3項(xiàng)下制備供試品溶液并按上述色譜條件進(jìn)行分析，計(jì)算回收率和RSD。結(jié)果表明，果糖、葡萄糖、蔗糖及總糖的平均回收率分別為105.9%、105.8%、105.3%及105.6%，RSD分別為3.5%、4.2%、3.5%及3.6%，回收率符合要求，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.9 樣品測(cè)定 按供試品溶液制備方法，取71批供試品溶液各5 μL，注入液相色譜儀，依法測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

3.1 糖類(lèi)物質(zhì)是含多羥基的醛類(lèi)或酮類(lèi)化合物。糖類(lèi)化合物包括單糖、單糖的聚合物及衍生物。以它們水解的情況分類(lèi)，凡不能被水解成更小分子的糖為單糖，能水解成少數(shù) (2～10個(gè))單糖分子的為寡糖 (或低聚糖)。由于冠心寧注射液的制備工藝中有二次醇沉過(guò)程，藥材中的多糖類(lèi)成分均被醇沉，故僅對(duì)藥材中的單糖寡糖進(jìn)行分析。

3.2 查閱文獻(xiàn)，目前各種單糖和寡糖的分析方法有薄層色譜法 (TLC)［5-7］、薄層色譜掃描法(TLCS)［7］、氣相色譜法［8-9］、高效毛細(xì)管電泳法(HPCE)［10］、聚丙烯酰胺凝膠電泳法 (PAGE)［11］、和高效液相色譜法 (HPLC)［12-13］。本實(shí)驗(yàn)擬采用高效液相色譜法，由于糖類(lèi)沒(méi)有紫外吸收，故用高效液相色譜法測(cè)定糖類(lèi)化合物多采用HPLC-RID、HPLC-ELSD和衍生化，為使方法簡(jiǎn)單、可行，本實(shí)驗(yàn)采用ELSD-HPLC法對(duì)糖類(lèi)成分進(jìn)行分析。

3.3 收集多個(gè)單糖、寡糖對(duì)照品，采用對(duì)照品對(duì)照法，通過(guò)保留時(shí)間比較，確證了色譜圖中3個(gè)主要色譜峰，分別為果糖、葡萄糖、蔗糖。

3.4 通過(guò)對(duì)6個(gè)不同企業(yè)抽驗(yàn)的71批樣品進(jìn)行果糖、葡萄糖、蔗糖3種糖的測(cè)定，分析3種糖質(zhì)量濃度可知，6個(gè)廠家的冠心寧注射液中均含有果糖、葡萄糖和蔗糖，但從數(shù)據(jù)可見(jiàn)F廠家的冠心寧注射液中蔗糖的質(zhì)量濃度極低，為1.943～5.306 mg/mL，B廠家的冠心寧注射液中的葡萄糖質(zhì)量濃度相對(duì)較低，為6.209～18.897 mg/mL。

表2 冠心寧注射液中單糖、寡糖準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果 (n=9)Tab.2 Results of recovery tests of Guanxinning Injection(n=9)

3.5 結(jié)合總固體物測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分析，3種糖總量占總固體比例為38.0%～90.9%，A廠家糖總量占總固體比例為42.0%～74.9%、B廠家糖總量占總固體比例為43.9%～58.8%、C廠家糖總量占總固體比例為38.0%～54.3%、D廠家糖總量占總固體比例為38.0%～90.9%、E廠家糖總量占總固體比例為48.5%～53.5%、F廠家糖總量占總固體比例為50.0%～77.0%。其中A廠家糖總量占總固體比例相對(duì)偏高，糖總量占總固體60%以上的占72.7%，C廠家和E廠家糖總量占總固體比例相對(duì)偏低。

表3 冠心寧注射液中單糖、寡糖測(cè)定結(jié)果 (n=2)Tab.3 Result of content determination of samples(n=2)

續(xù)表3

［1］衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑(第17冊(cè))［S］．1998:174．

［2］李秋怡，干國(guó)平，劉焱文．川芎的化學(xué)成分及藥理研究進(jìn)展［J］．時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2006，17(7):1298-1299．

［3］蔣愛(ài)軍，朱 斌，王鋼力，等．注射用丹參(凍干)中糖和糖醇類(lèi)成分的定性定量分析［J］．藥物分析雜志，2011，31(7):1313-1316．

［4］孫曉春，顏 軍，何 鋼，等．川芎多糖的分離純化及其單糖組成測(cè)定［J］．四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，29(1):56-60．

［5］張真慶，于廣利，管華詩(shī)，等．幾種糖醛酸及其寡糖的薄層層析分析［J］．分析化學(xué)，2005，33(12):1750-1752．

［6］焦廣玲，于廣利，趙 峽．幾種寡糖和單糖在不同展開(kāi)體系中的薄層色譜行為［J］．中國(guó)生化藥物雜志，2007，28(6):372-374．

［7］沈德艷，郁建平，張訓(xùn)海，等．幾種單糖、寡糖TLC條件的確立及草石蠶寡糖中水蘇糖含量測(cè)定［J］．食品工業(yè)科技，2009(9):306-308，310．

［8］周 欣，王慶彪，劉錫均，等．氣相色譜法檢測(cè)葡萄糖、麥芽糖、果糖和葡萄糖［J］．海峽藥學(xué)，2001(4):48-49．

［9］羅曉清，楊化新，楊洪淼，等．尖吻蝮蛇降纖酶寡糖鏈的甲基化分析［J］．藥物分析雜志，2010，30(3):357-360．

［10］賈國(guó)惠．糖類(lèi)的高效毛細(xì)管電泳分析［J］．中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2003，23(8):492-493.

［11］于廣利，遲連利，李桂玲，等．PAGE在海洋酸性寡糖分析中的應(yīng)用［J］．中國(guó)海洋藥物，2001，20(3):7-11．

［12］趙仁邦，劉孟軍，葛 微，等．高效液相色譜法測(cè)定棗中的糖類(lèi)物質(zhì)［J］．食品科學(xué)，2004，25(8):138-141．

［13］鄭小迅，李 澤，杜嘉木，等．高效液相色譜法測(cè)定寡糖鏈結(jié)構(gòu)［J］．分析化學(xué)，2005(3):291-295．